研究背景:随着经济迅速发展,人类寿命不断增加,疾病的增多严重影响了老年生活质量。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）及其磷酸化形式的NADP是各种基本代谢途径中氧化还原反应的主要辅酶。NAD可作为多种调节蛋白家族的底物控制重要的细胞过程,包括基因表达、DNA修复、凋亡、线粒体蛋白修饰等。烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）是哺乳动物细胞中NAD合成的限速酶。FK866（也称为APO866）是第一个NAMPT高度特异性抑制剂的化合物,它通过结合变构调节位点竞争性抑制NAMPT的酶活性,目前被开发为抗癌药且具有抗炎作用。衰老是不可逆的生物学过程,也是许多慢性疾病（包括癌症、神经退行性疾病和心血管疾病）的独立危险因素。自噬可降解并去除衰老或受损的细胞器和蛋白质,衰老时机体自噬能力下降、错误折叠蛋白质的聚集导致认知功能障碍,影响机体正常寿命,导致衰老相关的疾病发病率升高。因此,自噬增强剂已被认为是衰老和神经退行性疾病的治疗机会。目前已有大量报道,通过使用雷帕霉素、白藜芦醇、烟酰胺衍生物、二甲双胍、尿石素A和亚精胺增强自噬可延缓衰老并改善衰老的心血管功能。FK866是烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）抑制剂。实验发现老年小鼠1mg/kg（2次/周,ip.qod）FK866的剂量注射4周后,老年小鼠认知功能得到显著改善,但是与对照组老年小鼠相比,给予FK866的老年小鼠血清葡萄糖水平显著增加。本次实验老年小鼠以0.5mg/kg（3次/周,ip.qod）剂量注射FK866,小鼠认知功能得到显著改善且血糖无变化。已有研究表明,NAMPT在慢性神经炎症和老年小鼠、大鼠脑内的小胶质细胞诱导表达,FK866通过抑制脑内缺血灶小胶质细胞的激活抑制脑缺血后的炎症反应,起到神经保护作用。我们猜想FK866可否通过自噬和抗神经炎症作用用于抗衰老和与年龄有关的神经退行性疾病方面的研究。研究目的:1.揭示NAMPT抑制剂FK866对老年小鼠认知和学习行为的影响;2.揭示NAMPT抑制剂FK866改善老年小鼠认知功能障碍的机制。研究方法:采用自然衰老22月龄以及C57BL/6J 2月龄小鼠,根据月龄随机分成4组。腹腔注射0.5mg/kg FK866一个月（一次/2天）,所有模型小鼠进行多种行为学试验,用以评估小鼠行为与认知功能;采取小鼠血样,检测小鼠血液生理生化指标,免疫荧光染色后分析脑内各种神经细胞形态和表达数目,Western blot分析相关蛋白表达。1.生理生化指标检测（1）从腹腔注射FK866开始每次记录小鼠体重、进食情况以及健康状况;（2）甘油三酯比色法、葡萄糖氧化酶法、和胆固醇重氮法测量小鼠血清中甘油三酯、血糖、总胆固醇含量。2.行为学测试（1）矿场实验及十字高架迷宫实验评估小鼠焦虑样行为;（2）新物体识别及Y型迷宫实验评估小鼠短期空间记忆能力;（3）条件性恐惧测试评估小鼠海马依赖性的恐惧记忆能力;（4）RotaRod转棒实验评估小鼠的运动能力。3.免疫荧光和Western blot检测（1）免疫荧光染色实验标记GFAP、Iba1、Ub及p62蛋白,分析脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的形态和数量、泛素在神经元中的表达情况以及神经元中自噬表达情况;（2）Western Blot检测小鼠脑皮层和皮层下组织、GFAP、CD11b、Ub、LC3蛋白表达水平。研究结果:1.低浓度FK866对老年小鼠血糖、血清总胆固醇、甘油三酯的血液理化指标无显著影响。2.低浓度FK866能部分改善认知功能及运动能力,并对焦虑样行为无影响新物体识别实验结果表明,低浓度FK866能改善老年小鼠短期记忆功能;条件性恐惧实验结果表明低浓度FK866能部分改善老年小鼠恐惧记忆;RotaRod转棒实验结果显示,低浓度FK866能改善老年小鼠运动能力;开放场及高架十字迷宫结果表明显示,低浓度FK866对老年小鼠焦虑样行为无显著影响。3.低浓度FK866能部分抑制老年小鼠皮层下小胶质细胞和星形胶质细胞的激活;低浓度FK866增强了老年小鼠LC3Ⅱ水平并且降低了老年小鼠Ub蛋白沉积水平。结论:腹腔注射小剂量FK866能改善老年小鼠认知功能障碍。抑制NAMPT的表达能够在一定程度上预防老年性痴呆。研究背景:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的维持已成为一种共识,NAD是氧化还原反应的经典辅酶,对于多种组织和器官的功能至关重要。随着年龄增长,小鼠胰腺、肌肉、肝脏、脑、脂肪组织的NAD水平逐渐下降。研究表明NAD水平下降与二型糖尿病、阿尔兹海默症（AD）、帕金森综合症（PD）以及神经退行性疾病密切相关。补充NAD能改善多种神经退行性疾病、帕金森症状,预防老年痴呆,延长机体寿命。NAD不仅参与许多关键的代谢途径,例如糖酵解、三羧酸循环和线粒体氧化磷酸化。还用于合成基本化合物,包括大多数三磷酸核苷和某些氨基酸。合成NAD的前体主要有五种:色氨酸、烟酰胺和烟酸（两种形式的维生素B3）、烟酰胺核糖苷和烟酰胺单核苷酸。其中,烟酰胺是哺乳动物NAD生物合成的主要前体,该途径的主要限速步骤由烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）介导。通过介导NAD的合成,NAMPT表达在机体生命活动中起着非常重要的作用。神经元中NAMPT表达对认知和行为功能至关重要。而认知功能障碍是全球人口老龄化中最令人担忧的结果之一,虽然在衰老过程中削弱认知功能的机制仍然难以捉摸,但目前已经确定,包括大脑在内的多种组织和器官中NAD水平降低,衰老过程中海马NAD水平也明显下降,海马中NAD和NAMPT表达水平随着年龄的增长而降低。通过实验模拟NAMPT在小鼠原发性海马体中NAD随年龄依赖性下降的生理状态,并证明海马神经元NAMPT水平下降导致小鼠认知功能障碍。已有研究者使用前脑兴奋性神经元中缺乏Nampt的小鼠（CaMKⅡαNampt-/-小鼠）,该模型小鼠表现出过度活跃、学习和记忆功能障碍以及焦虑样行为下降的现象,实验结果均与NAMPT表达相关联,表明NAMPT在认知功能中的重要性。该研究自胚胎期即敲除了Nampt基因,导致神经元发育异常,故很难区分NAMPT是影响神经元发育,还是参与神经功能。因此,本次实验在namptwt/wt、namptwt/flox、namptflox/flox三种基因型小鼠通过注入rAAV-hSyn-Cre-WPRE-pA病毒,通过条件性基因敲低、敲除小鼠来探究海马神经元中NAMPT的表达在认知功能方面的影响。研究目的:1.揭示海马CA1区神经元表达NAMPT在小鼠认知和学习行为中的作用;2.阐明海马CA1区神经元NAMPT表达抑制,对小鼠脑内神经炎症的影响。研究方法:采用 2 月龄 namptwt/wt、namptwt/flox、namptflox/flox 转基因小鼠,rAAV-hSyn-Cre-WPRE-pA病毒注射一个月后,所有模型小鼠进行多种行为学试验,用以评估小鼠行为与认知功能;免疫荧光染色后分析脑内各种神经细胞形态和表达数目,Western blot分析相关蛋白表达。1.生理生化检测采用NAD检测试剂盒,检测海马组织NAD水平;2.行为学测试（1）矿场实验及十字高架迷宫实验评估小鼠焦虑样行为;（2）新物体识别及Y型迷宫实验评估小鼠短期空间记忆能力;（3）条件性恐惧实验评估小鼠海马依赖性的恐惧记忆能力。3.免疫荧光和Western blot检测（1）免疫荧光染色标记Cre、NAMPT、GFAP、Iba1及Map2蛋白,分析神经元NAMPT蛋白的表达情况,分析脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的形态和数量。（2）Western Blot检测小鼠脑皮层下组织NAMPT、GFAP、Iba1蛋白表达水平。研究结果:1.rAAV-hSyn-Cre-WPRE-pA病毒在小鼠海马CA1区表达,NAMPT与Cre免疫荧光共染结果表明小鼠CA1区Nampt基因特异性敲除,且海马CA1区神经元形态、数量无异常变化。2.海马CA1区Nampt基因特异性敲除能部分导致认知功能障碍,但对焦虑样行为无影响。新物体识别实验结果表明,海马CA1区Nampt基因特异性敲除能导致年轻小鼠短期记忆功能障碍;条件性恐惧实验结果表明海马CA1区Nampt基因特异性敲除能部分引起老年小鼠恐惧记忆功能障碍;开放场及高架十字迷宫结果表明显示,海马CA1区Nampt基因特异性敲除对年轻小鼠焦虑样行为无显著影响;与WT小鼠对比,海马CA1区Nampt基因敲低小鼠行为变化无差异。3.海马CA1区Nampt基因特异性敲除能部分激活年轻小鼠皮层下小胶质细胞和星形胶质细胞。结论:小鼠海马CA1区神经元表达NAMPT通过合成NAD参与小鼠学习记忆,神经元NAMPT减少可以损伤小鼠的认知功能,激活胶质细胞。