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研究背景和目的食管癌(esophagus cancer,EA)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,在中国常见恶性肿瘤相关死因排行中,食管癌排行第三。食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,ECA)是最常见食管恶性肿瘤的两种组织学类型,在我国食管鳞状细胞癌占所有食管癌的95%,虽然现在对于食管鳞癌的诊断和治疗水平都有较大提升,但其总5年生存率只有17%,很大一部分原因是食管鳞癌早期症状不明显,且缺乏敏感性和特异性高的肿瘤标志物,所以不少患者就诊时分期偏晚。因此,寻找新的高特异性和高敏感性的食管鳞癌的肿瘤标志物,及深入对食管鳞癌发生发展过程的研究,不仅有利于食管癌的早期诊断、预后评估,而且有利于有效地提高食管癌患者疗效、改善预后。单核细胞是骨髓髓系祖细胞发育而来的,是外周血一种单个核吞噬细胞,同时也是固有免疫系统的重要构成部分。依据单核细胞的表面标志物CD14和CD16,单核细胞被分成经典型(CD14++CD16-)、中间型(CD14++CD16+)、非经典型(CD14+CD16++)三个亚群。近年来有学者参考肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)分型方法,把外周血单核细胞分为促炎型单核细胞(M1)和抗炎型单核细胞(M2)。目前已有不少研究证实在多种肿瘤患者中存在着外周血单核细胞亚群以及促炎(M1)和抗炎(M2)极化失衡,比如肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。外周血单核细胞浸润至肿瘤微环境中并分化为肿瘤相关巨噬细胞,其中包括M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。研究显示在肿瘤组织中,肿瘤相关巨噬细胞的在功能上更倾向于CD206标记的的M2型巨噬细胞,即促进肿瘤的发生、血管生成、侵袭转移及免疫抑制。然而在这些肿瘤患者中单核巨噬细胞的M1/M2极化的机制仍然不完全清楚。IL-33(interleukin 33)是2005年发现的一种IL-1家族的多功能炎症因子,目前认为IL-33在非特异性和特异性免疫中发挥了重要作用,并且有助于维持组织内稳态和对环境的应激反应。大量研究证实IL-33参与临床各种疾病的发生发展过程,而在肿瘤领域,IL-33通过多种途径参与了肿瘤的发生发展,包括募集单核巨噬细胞至肿瘤微环境中并且调节其向M2型巨噬细胞极化以促进了肿瘤的进展。迄今仍然缺乏单核-巨噬细胞和IL-33在食管鳞状细胞癌中的研究。通过本研究我们将揭示食管癌患者外周血及食管癌组织中单核巨噬细胞亚群的状态以及其与IL-33的关系,达到为食管鳞癌提供潜在的肿瘤标志物以及潜在治疗靶标的目的。方法1.检测食管鳞癌患者循环单核细胞亚群以及其与临床病理特征的相关性分析利用流式细胞学方法检测48例食管鳞癌患者以及33例正常对照循环单核细胞亚群状态。依据CD14和CD16的表达状态,检测经典型(CD14++CD16-)、中间型(CD14++CD16+)和非经典型(CD14+CD16++)三个亚群在循环总单核细胞中各占的百分比。同时检测M1型单核细胞(CD68+CCR2+)和M2型单核细胞(CD163+CX3CR1+)在单核细胞中各占的百分比,并计算M1/M2型比值。采用独立t检验方法比较病例组与对照组各亚群有无显著性差异,并根据食管癌患者临床病理特征分为若干亚组,进一步分析显著差异的亚群与患者临床病理特征有无相关关系。2.IL-33和M1/M2型巨噬细胞在食管鳞癌组织中的检测分析利用免疫组化技术检测IL-33和M1/M2型巨噬细胞的相关标记物在83例食管鳞癌组织和癌旁正常组织中的表达水平,其中M1和M2型巨噬细胞分别以CD68、CD206标记。并且分析IL-33与M1/M2型巨噬细胞在食管鳞癌组织中表达有无相关。同时利用western blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法验证IL-33、CD206在其中的7例食管鳞癌组织和癌旁正常组织的蛋白以及mRNA水平。3.IL-33对THP-1细胞的体外诱导分化的作用利用佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)、IL-13 和 IL-33 单独或其联合诱导人单核细胞株THP-1分化成巨噬细胞,利用流式细胞学的方法检测诱导后的巨噬细胞CD206的表达水平以及利用qRT-PCR方法检测被诱导的巨噬细胞IL-10、TGF-β、IL-12和IL-23的mRNA水平来确定巨噬细胞的表型,以此来探究IL-33对THP-1细胞的诱导分化作用。4.IL-33扩增诱导的M2型巨噬细胞对食管鳞癌细胞株ECA109的体外功能影响取IL-33诱导扩增的M2型巨噬细胞的上清,与食管鳞癌细胞株ECA109共培养48小时后,利用划痕愈合实验、transwell小室迁移试验检测被诱导后的ECA109细胞株的迁移能力的变化。利用qRT-PCR及western blot检测共培养后的ECA109细胞株上皮间质转化(EMT)相关因子的mRNA及蛋白水平的变化,以明确IL-33诱导扩增的M2型巨噬细胞对食管鳞癌细胞的功能影响。5.统计学分析实验结果利用prism7.0及SPSS 20软件分析数据,当P<0.05时,认为差异具有统计学意义。结果1.检测食管鳞癌患者循环单核细胞亚群以及其与临床病理特征的相关性分析流式细胞学检测结果显示:依据标准CD14/CD16分型,单核细胞经典型(CD14++CD16-)、中间型(CD14++CD16+)、非经典型(CD14+CD16++)三个亚群各占百分比在食管癌患者与正常对照之间均没有显示统计学差异。然而循环M2型单核细胞(CD163+CX3CR1+)占总循环单核细胞的百分比相比于正常对照显著升高,M1型单核细胞(CD68+CCR2+)则没有显著差异,进一步分析显示M2型单核细胞百分比与T分期、N分期以及TNM总分期相关,但与性别、年龄、肿瘤位置和肿瘤分化程度不相关。2.IL-33和M1/M2型巨噬细胞在食管鳞癌组织中的检测分析免疫组织化学结果显示,IL-33和M2型巨噬细胞标志物CD206在83例食管鳞癌组织中的表达均高于癌旁正常组织(P<0.05)。且均与与N分期、TNM总分期相关,但与T分期、性别、年龄、肿瘤位置和肿瘤分化程度不相关。进一步统计分析显示,IL-33与CD206在食管鳞癌组织中表达有具有正相关性。qRT-PCR和western blot结果显示:7例配对食管鳞癌组织及癌旁正常组织中,癌组织的IL-33和CD206 mRNA和蛋白水平均显著高于癌旁正常组织。3.IL-33对THP-1细胞的体外诱导分化的作用利用PMA、IL-13和IL-33单独或其联合诱导人单核细胞株THP-1分化成巨噬细胞,流式细胞学检测和real-time PCR检测结果显示当在IL-13存在时,IL-33能极大的提高诱导后巨噬细胞CD206的表达和IL-10、TGF-β的mRNA水平,故而IL-33具有显著增强IL-13诱导THP-1分化为M2型巨噬细胞的能力。4.IL-33扩增诱导的M2型巨噬细胞对食管鳞癌细胞株ECA109的体外功能影响划痕愈合试验、transwell小室迁移试验结果显示,IL-33诱导扩增的M2型巨噬细胞上清液与食管鳞癌细胞株ECA109共培养后,其迁移能力相对于对照组显著增强(P<0.05)。进一步采用real-time PCR和western blot检测EMT相关分子标志物,发现共培养后ECA109细胞中上皮分子标志物E-Cadherin相比于对照组表达显著降低,而间质分子标志物Vimentin和N-Cadherin表达升高,提示IL-33诱导扩增的M2型巨噬细胞能促进食管鳞癌细胞株ECA109迁移和上皮间质转化。结论食管鳞癌患者外周血M2型单核细胞所占总单核细胞比例较正常人升高,具有一定的辅助诊断价值。IL-33可诱导单核-巨噬细胞向M2型分化,继而后者促进食管鳞癌细胞的迁移和EMT,据此,IL-33和M2型巨噬细胞有望成为食管鳞癌的潜在治疗靶标。本研究的创新之处1.首次从食管鳞癌患者临床标本中检测了 IL-33和单核巨噬细胞亚群的表达水平,并分析其相关性。2.从体外实验初步揭示IL-33可通过增强IL-13诱导THP-1细胞向M2型巨噬细胞极化的能力,而且IL-33诱导的M2型巨噬细胞具有促进食管鳞癌细胞株ECA109迁移和EMT的作用。