论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)均由冠状病毒引起,临床上主要以呕吐、腹泻和脱水为特征,对哺乳仔猪的致死率可达100%,给养猪业造成了巨大的经济损失。特别是近年来其发生率明显升高,因此,作者对河南省不同地区的猪场进行了TGE和PED感染和流行情况的调查,并对流行毒株进行了相关研究。参照Genbank中登录的基因序列(NC002306和NC003436)分别设计了扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)(P1/P2)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)(P3/P4)的两对引物, P1/P2的扩增长度为497bp,P3/P4的扩增长度为854bp。通过优化反应条件,作者首先建立了分别检测TGE和PED的单一RT-PCR方法,用其分别扩增猪胃-流二联弱毒活疫苗中TGEV和PEDV的目的基因,并进行连接、转化、克隆和测序。结果表明TGEV和PEDV目的基因的同源性均在98.5%以上,证明了扩增目的基因的正确性。随后建立了同时检测TGE和PED的多重RT-PCR方法。用该方法检测7份临床疑似TGE和PED的肠道内容物,结果表明TGE和PED均为阳性。同时用单一RT-PCR方法和韩国进口试纸卡检测同样的7份样品,与多重RT-PCR方法检测相比,结果表明TGE的符合率分别为7/7和7/7,PED的符合率分别为7/7和5/7。对RT-PCR检测呈阳性结果的7份临诊病料进行病毒的分离、鉴定,结果均分离到病毒,但所分离物全为TGE和PED混合病毒TGE-PED(HN)。在PK-15细胞和Vero细胞上连续多次传代后仍表现为二者的混合感染。选用琼脂粉作为固定介质,试图通过蚀斑技术对分离到的混合病毒TGE-PED(HN)进行克隆、纯化,但经多次努力均未成功。随后对分离到的TGE-PED(HN)中TGEV S基因和PEDV M基因进行了克隆、测序和序列分析,结果表明TGEV S基因(序列登录号为EU287428)同猪胃肠炎弱毒活疫苗株之间的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.0%和97.6%,在进化关系中与已报道的四川分离株(DQ443743)之间的进化距离最近;PEDV M基因(序列登录号为EU287429)同猪流行性腹泻弱毒活疫苗株之间的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99.7%和97.0%,在进化关系中与猪流行性腹泻弱毒活疫苗株之间的进化距离最近。但是目前还不能说明TGE-PED(HN)是否与猪胃-流二联弱毒活疫苗株的毒力返强有关。本研究分离到了河南株猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒,对研究TGE-PED(HN)和猪胃-流二联弱毒活疫苗株之间的关系,TGEV和PEDV在细胞上增殖过程中二者之间的关系以及TGEV和PEDV的生物学性状、疫苗开发和防治有重要意义。