研究背景：食管癌（EC）是最为常见的恶性肿瘤之一，居男性第六位、女性第九位。世界范围内癌症患者死亡原因中食管癌居第六位。在其病理分型中，鳞癌超过90%。EC的预后较差，经过临床医生及研究者近半个世纪的努力，患者总体5年生存率只有12％左右[1]。在食管癌的治疗中，当前国际公认的是以手术切除为中心、再结合放疗、化疗的治疗策略。改善症状及延长患者生存时间是第一位的治疗目标。EC预后差的主要原因是肿瘤容易发生周围组织侵袭及转移，手术不能完整切除；其次是易对化疗产生耐药，导致化疗失败。顺铂是临床上食管鳞癌化疗最常用的药物，其药理作用主要是与细胞核蛋白连接，形成重金属离子与DNA链的交联，最终造成DNA链的损伤。食管鳞癌在化疗刚开始时是比较敏感的，但多在数个周期后逐渐出现对药物的耐受，降低了顺铂的治疗效果，这是化疗成功的主要障碍。因此，深入了解耐药机制非常重要，可以为耐药逆转及肿瘤治疗提供新的策略。细胞的自我适应是造成食管癌耐药的主要原因：细胞膜上的转运蛋白合成增加使得转运功能增强，将细胞内的化疗药物排出，浓度下降到有效治疗浓度以下；癌细胞对抗肿瘤药物的生物转化作用增强；谷胱甘肽等抗氧化剂失活；DNA修复功能得到增强；细胞中信号传导相关基因的不正常表达导致凋亡信号传导的异常等。这些都可导致癌细胞对化疗药物的耐药。1993年，Wang等发现在温度敏感的结构中表达的野生型p53（温度敏感p53基因），可以触发p53阴性的T细胞淋巴瘤细胞J3D的v-myc逆转录病毒诱导的细胞凋亡[2]。1995年，Wang等[3]对此现象进行进一步深入的研究以后发现了一个新的基因――WIG-1，为p53基因所诱导，其包含的两个7.6kb和2.2kb的转录子在转染p53基因的J3D淋巴瘤细胞中的表达明显有上调。过表达p21的成纤维细胞NIH-3T3经γ射线照射后可以诱导WIG-1基因的转录。γ射线照射全身可以诱导大鼠的睾丸、脑、脾、肺和肾脏组织WIG-1表达水平上调，而在未接受γ射线照射的睾丸、脑、和肾脏组织中也可检测到WIG-1存在基础水平表达[4]，深入研究表明WIG-1的表达可以由p53所诱导，是一种锌指蛋白，包含3个锌指样结构，这3个锌指结构能够与特定RNA、蛋白及DNA结合，人类WIG-1与包括小干扰RNA和micro RNA在内的不同类型的双链RNA结合后，能够发挥抑制细胞生长的作用[5]。还有文献证明，人WIG-1能够显著抑制食管鳞癌细胞增殖，抑制率超过25%[6]，还有研究者认为WIG-1可能在micro RNA调节的细胞生长和生存过程中发挥作用，并且具有启动p53诱导的凋亡过程或细胞增殖停滞的作用，WIG-1与特殊的miRNA相结合能够增加由miRNA和它的信使RNA形成的有缺陷的小二重区域的稳定性[7]。WIG-1基因由于对细胞生长周期和凋亡具有调控作用，使研究者相信WIG-1有可能对肿瘤耐药细胞也会产生相应的调控作用。研究目的：本研究拟通过构建食管鳞癌EC109细胞株耐药亚系，并克隆人WIG-1基因，构建高表达及干扰慢病毒表达载体，分别转染食管癌EC109的耐药细胞亚系；探讨WIG-1对食管鳞癌耐药细胞化疗药物敏感性及相关生物学行为的影响和机制，为深入理解WIG-1在食管鳞癌中的作用进行探索。研究方法：1.通过顺铂间歇给药冲击诱导的方法建立对顺铂耐药的人食管鳞癌细胞株（EC109/CDDP）。2.构建含WIG-1/sh WIG-1基因的慢病毒载体。3.将携WIG-1/sh WIG-1基因的慢病毒载体转染EC109/CDDP细胞系。运用CCK-8法检测细胞WIG-1表达改变对顺铂化疗耐药性的影响。4.运用Western Blot法检测WIG-1表达改变对bcl-2，Bax，GST-，ERCC1等凋亡及耐药相关基因的影响；使用流式细胞仪等检测凋亡率及细胞周期的变化。5.建立慢病毒载体转染的EC109/CDDP细胞株裸鼠肿瘤模型，运用动物模型研究WIG-1表达对顺铂化疗耐药性的变化。结果：1.成功诱导建立了对顺铂耐药的人食管鳞癌细胞株（EC109/CDDP）。2.成功构建了WIG-1基因干扰及过表达的慢病毒载体，并成功感染EC109/CDDP细胞，可稳定的升高/降低WIG-1基因在EC109/CDDP细胞中的表达。3.上调WIG-1基因在EC109/CDDP细胞中的表达，会恢复肿瘤细胞对顺铂的敏感性；下调WIG-1基因在EC109/CDDP细胞中的表达，可以降低肿瘤细胞对顺铂的敏感性。4.上调WIG-1基因在EC109/CDDP细胞中的表达，肿瘤细胞的凋亡水平升高；下调WIG-1基因在EC109/CDDP细胞中的表达，肿瘤细胞的凋亡水平下降。5.成功建立了对顺铂耐药的人食管鳞癌细胞株（EC109/CDDP）裸鼠皮下移植瘤模型。6.在裸鼠模型上，利用小动物活体荧光成像等技术发现WIG-1基因上调的EC109/CDDP瘤体对顺铂的敏感性增加；WIG-1基因下调的EC109/CDDP瘤体对顺铂的敏感性降低。7.上调WIG-1基因在EC109/CDDP细胞中的表达，可以在蛋白水平显著降低ERCC1的表达，显著增加Bax的表达；下调WIG-1基因在EC109/CDDP细胞中的表达，可以显著提高ERCC1的表达，显著降低Bax的表达。结论：1.本实验成功建立了对顺铂耐药的人食管鳞癌细胞株（EC109/CDDP），构建了WIG-1基因上调/下调表达的慢病毒载体，并将其转入耐药株，建立了稳定上调/下调WIG-1基因的人食管鳞癌细胞系EC109/CDDP/WIG-1、EC109/CDDP/sh WIG-1。2. WIG-1在对体外培养的对顺铂耐药的人食管鳞癌细胞株中过表达可以部分恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，逆转耐药；而干扰其表达可显著增加癌细胞对化疗药物的耐药性。3.高表达WIG-1可增强裸鼠食管鳞癌耐药株移植瘤对CDDP的敏感性，而干扰WIG-1表达可增强裸鼠移植瘤对CDDP的耐受性，表明WIG-1基因可逆转食管鳞癌细胞产生的耐药性，是一个参与调控食管鳞癌细胞耐药性的新基因。4. WIG-1逆转耐药的机制可能是：降低了耐药基因ERCC1的表达，增强了凋亡基因Bax的表达。5.动物活体成像系统能够更加准确地反映肿瘤生长的实际情况，有利于减小实验误差，所获得的实验结果更加直观可靠。