罗氏沼虾(Macrobrachiun rosenbergii)是一种重要的淡水经济虾类,主要分布在印度、太平洋热带及亚热带地区。其食性杂,生长快,生殖周期短,个体大,具有很高经济价值。但目前对其生殖和受精的分子机制知之甚少。本文以雄性罗氏沼虾为研究对象,开展关于精子成熟与生殖相关分子的研究,内容如下：首先,采用全长均一化消减杂交(Full-Length Normalization Subtractive Hybridization, FNSH)的方法,建立雄性生殖系统壶腹特异性基因的消减文库。通过差异性筛选并测序,获得5个壶腹特异性的序列。其中一个基因全长768bp,编码区264bp,编码生成88个氨基酸,推演的多肽含有17个氨基酸的信号肽和71个氨基酸的成熟肽。Genebank序列比对分析,没有发现任何同源的核酸和蛋白质序列,为一个全新的基因,命名为TAP(Terminmal Ampullae Peptide)。第二,TAP基因的表达特征检测。采用半定量PCR的方法,研究基因表达的组织特异性,结果表明其主要在雄性生殖系统的壶腹中表达,且随着雄性个体的生长发育其表达量增加。通过原位杂交的方法,研究基因的组织定位,发现壶腹和精巢上都有表达,且在壶腹的内壁表皮分泌细胞和促雄性腺体细胞,精巢的生精细胞中表达。第三,TAP蛋白的组织分布检测。采用Western blotting的方法,研究蛋白的组织分布,结果表明在雄性生殖系统的壶腹和精子中分布,且随着雄性个体的成熟其表达量增加。通过免疫组化的方法,研究蛋白的组织定位,结果表明在壶腹内壁的表皮分泌细胞和精子细胞中分布。通过免疫荧光和透射电镜免疫组化的方法,进一步研究其在精子上的精细分布,结果表明其分布于精子基部的突出部位和棘部。第四,TAP基因的功能研究。采用RNA干扰的方法,研究其在精子成熟和受精过程中的作用。利用半定量PCR和Western blotting的方法,检测干扰效率,结果显示核酸和蛋白表达水平下降90%以上,干扰有效。TAP基因沉默的雄性罗氏沼虾在外观形态和行为上没有异常；雄性生殖系统中精巢的生精过程,输精管中精子数量和壶腹中精荚的形成,都没有变化。但是,壶腹中精子的活力发生了巨大改变。利用明胶SDS-PAGE的方法,检测精子的蛋白水解活力,结果发现干扰后精子的蛋白水解活力明显降低。同时,利用体外孵育精子提取物和卵膜蛋白的方法,研究精子穿透卵膜能力,结果显示干扰后精子降解卵膜蛋白能力下降。这些结果表明,TAP蛋白参与调节壶腹中精子水解蛋白酶的活力。进一步研究TAP蛋白在受精和受精卵发育过程中的可能作用,取干扰后雄虾与卵巢发育成熟的雌虾进行交配受精,观察受精和受精卵的发育。结果表明干扰后的雄虾能与雌虾正常受精且受精率不受影响；受精卵正常卵裂。但是,受精卵的卵膜蛋白组成发生极大变化,干扰组的卵膜蛋白在受精后未被降解。这些结果表明,TAP蛋白主要参与卵膜蛋白降解相关酶的活力调节,但不影响精子入卵和受精过程。