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芳香羟胺是一种非常重要的化学中间体,广泛用作抗聚合剂、抗氧化剂、农药、医药、化妆品、电子等产品。此外,芳香羟胺本身也具有很高的药理及生理活性。目前芳香羟胺的合成方法主要是过渡金属催化的硝基化合物还原,该方法存在的主要问题包括：羟胺难以可控地合成,易于进一步还原成胺,催化剂难以降解,价格昂贵。针对上述问题,本研究开发了一种利用硝基还原酶(Nitroreductase)催化还原硝基化合物合成羟胺的方法,该方法具有高选择性、可控性、反应条件温和、不需要严格控制反应时间和催化剂量等优点。本研究首先采用基因挖掘的方法,从庞大的基因库中筛选获得了一种来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的硝基还原酶(BaNTR1),通过亲和镍柱层析对其进行纯化,并对纯化后的蛋白进行了酶学性质研究。结果表明：该酶的最适温度为35℃,最适pH值为7.0；该酶在40℃,50℃和60℃的半衰期分别为65h,18h和0.39h；金属离子Cu2+和Ag+对该酶有强烈的抑制作用；该酶对对硝基苯甲腈底物的动力学常数Vmax和Km分别为77.6μmol min-1mg-1protein口0.16mM。在巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶BmGDH作为催化剂用于辅酶循环再生的10mL反应体系中,添加0.3NADP+和10mg BaNTR1冻干酶粉,1h内100mM的对硝基苯甲腈被完全转化,产物羟胺的化学选择性>99%。值得注意的是,随着反应时间的延长,羟胺并未被进一步还原成胺或形成其他副产物,其选择性依然>99%。底物谱研究表明：BaNTR1对带有吸电子基团(氰基、羧基、羰基、酰胺基、硝基)的芳香硝基底物具有很好的活性和选择性,而对带有供电子基团的芳香硝基化合物,虽然也能被转化(96.7%转化率),但形成的产物中并未检测到芳香羟胺,这表明该方法较适合于带有吸电子基团的芳香羟胺合成。本研究也对BaHTR1口BmGDH基因在E. coli BL21中进行了串联共表达的研究。利用10g/L共表达的冻干细胞作为催化剂,在不额外添加辅酶的情况下,100mM的对硝基苯甲腈在1h内转化率为100%,选择性>99%。为了提高反应中底物的上载量,我们对两相反应体系进行了研究。结果显示：在甲苯/水两相反应体系(v/v,1/1)中,底物的上载量从100mM提高至300mM,300mM的对硝基苯甲腈在2.5h内即被完全转化,选择性仍保持在99%以上。综上所述,本研究为芳香羟胺建立了一个高选择性可控的酶促合成方法。