研究背景血管新生(angiogenesis)是指先前已经存在于组织的成熟血管在外界作用下生长形成新的微血管的过程。血管新生涉及到多个生理过程,主要包括血管内皮细胞的激活,增殖,迁移,分化,成熟及小管形成等。血管内皮细胞(endothelial cell)在血管新生过程中起关键作用。异常的血管新生表现为血管新生过度或血管新生缺陷,参与肿瘤,风湿病和糖尿病等疾病的发生发展。阻断异常的血管新生,无疑成为治疗血管新生性疾病的一个重要手段。青蒿素是从绿色青蒿植物里萃取的倍半萜烯内酯内过氧化物,广泛用作抗疟药物。青蒿素及其衍生物在细胞模型和动物模型中都显示出较强的抗血管新生作用。双氢青蒿素(Dihydroartemesinin,DHA)是一种青蒿素的半合成衍生物,水溶性高,在抗疟治疗中毒副作用较少,在实体肿瘤模型中已被证实具有抗血管新生作用,但这种效应的具体分子机制尚不明确,限制了其在临床治疗上的应用。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth fator,VEGF)是主要的促血管内皮细胞生长因子,VEGF在内皮细胞中与其受体VEGFR2结合后可以激活下游信号通路,并且促进血管新生。另外,细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路可以诱导内皮细胞增殖。本研究假设DHA在内皮细胞中通过抑制VEGFR和ERK信号通路的激活来发挥抗血管新生作用。研究目标(1)体外细胞学实验确认DHA对HUVECs增殖和迁移的作用;(2)体外细胞学实验确认DHA抗血管新生的具体分子学机制;(3)在小鼠视网膜血管新生模型中,确认DHA抗血管新生作用及其分子机制。研究方法(1)质粒构建pGL3-basic多克隆位点载体用于构建包含VEGFR2启动子片段质粒和NF-kB突变质粒,其中VEGFR2启动子选择-115到+296片段,VEGFR2启动子的-90 NF-κB 碱基序列由 GGAGAGCCCC 突变为 AAAGAGCCTT。(2)对细胞进行转染与刺激对于剂量梯度实验,终浓度为0,1,5,25和100 μM DHA分别刺激HUVECs;对于时间梯度实验,DHA刺激后的0,0.5,1,3,6,12和24小时进行下一步检测;为验证DHA是否影响NF-kB信号通路,本实验用终浓度为100 μM的PDTC(NF-κB信号通路抑制剂)预刺激细胞1小时,以阻断NF-κB信号通路;为验证DHA是否影响ERK信号通路,本实验用终浓度为10 μM的PD98059(ERK信号通路抑制剂)预刺激细胞1小时,以阻断ERK信号通路:对于质粒转染实验,六孔板每孔加0.75μg质粒,使用lipo3000转染试剂转染后进行后续实验。(3)MTT实验采用MTT增殖实验,检测不同浓度梯度DHA刺激HUVECs后的增殖能力;对于NF-kB信号通路的检测,细胞分为对照组(DMSO)、DHA组(25μM)、PDTC 组(100 μM)和 PDTC+DHA 组(100 μM+25 μM);对于 ERK 信号通路的检测,细胞分为对照组(DMSO)、DHA组(20μM)、PD98059组(10μM)和PD98059+DHA组(10 μM+20 μM),分别比较各组HUVECs的增殖能力。(4)细胞迁移实验将HUVECs接种于上层小室中,细胞分为对照组(DMSO),DHA组(25μM),PDTC 组(100μM),PDTC+DHA 组(1000μM+25μM),细胞刺激 12小时后,采用结晶紫染色的方法比较各组细胞的迁移能力。(5)实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)通过提取DHA(25μM)或PDTC+DHA刺激后的HUVECs总RNA,进行逆转录和PCR等步骤分别检测HUVECs中VEGFR1,VEGFR2的基因表达情况;提取DHA(20 μM)刺激HUVECs后的总RNA,进行逆转录和PCR方法分别检测HUVECs中ERK1,ERK2,c-fos和c-myc的基因表达情况。(6)蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)提取 DHA(25 μM)或 PDTC+DHA(100 μM+25 μM)刺激 HUVECs 后的细胞总蛋白质和细胞核蛋白质,进行凝胶电泳,转膜,一抗二抗孵育和ECL发光液曝光等步骤分别检测VEGFR1,VEGFR2,IκB-α,NF-KB p65和磷酸化ERK1/2(p-ERKl/2),ERK1/2,c-fos,c-myc 蛋白的表达情况。(7)免疫荧光(Immunofluorescence)细胞分为对照组(DMSO),DHA 组(25 μM),EGF 组(100 μM)和 EGF+DHA组(100 μM+25μM),各组细胞加药刺激2小时后进行固定,一抗二抗孵育,显微镜采集图片等步骤,直观观察DHA和/或EGF刺激HUVECs后,细胞中NF-κB p65蛋白的表达和分布情况。(8)细胞电子阻抗传感系统(Electric cell-substrate impedance sensing,ECIs)将HUVECs接种于ECIs电极板中,对于NF-kB信号通路的检测,细胞分为对照组(DMSO)、DHA 组(25μM)、PDTC 组(100pM)和 PDTC+DHA 组(100 μM+25 μM),检测各组细胞的实时跨细胞电阻大小来比较各组内皮细胞通透性变化;电极点刺激各孔细胞后,通过检测各组细胞实时跨细胞电阻增加的快慢来确定细胞迁移能力的变化;对于ERK信号通路的检测,细胞分为对照组(DMSO)、DHA 组(20 μnM)、PD98059 组(10μM)和 PD98059+DHA 组(10μM+20μM),通过检测各组细胞的实时跨细胞电阻增加的程度,比较各组细胞增殖能力的变化。(9)染色质免疫沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)通过超声波裂解DHA刺激后的HUVECs,得到最佳长度的DNA片段,加入NF-κBp65蛋白抗体获取目的片段DNA,经纯化后,用VEGFR2启动子引物进行PCR扩增,检测NF-kB p65与VEGFR2启动子结合的能力。(10)构建视网膜新生血管动物模型建立小鼠视网膜新生血管模型,小鼠分为两组,每组至少3只。第一组小鼠为注射DHA组:从小鼠出生后的第12天(P12)到P14每天向小鼠左眼玻璃体角膜缘后部200 μm处注射用PBS稀释的0.5 μl浓度为0.1 mM的DHA,小鼠右眼同个部位只注射0.5μlPBS;第二组小鼠为PDTC组:从P12到P14每天向小鼠左眼玻璃体角膜缘后部200 μm处注射用PBS稀释的0.5 μl浓度为0.1 mMDHA和浓度为0.5 mM的PDTC,向右眼同个部位只注射浓度为0.5mMPDTC。在P17时处死小鼠,通过视网膜血管密度分析实验,在活体动物模型中确认DHA抗血管新生作用及机制。(11)统计学分析所有实验数据均表示为均数土标准差(mean土SD)的形式,采用SPSS 19.0软件处理分析数据。组间比较采用配对t检验,所有实验至少重复3次,P<0.05时有统计学意义。研究结果(1)MTT实验和Transwell小室迁移实验结果表明,DHA以剂量依赖性方式抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖和迁移,且DHA终浓度为20-25μM 或再高浓度的情况下,效果明显。(2)WB和qRT-PCR实验结果表明,DHA特异性下调HUVECs中VEGFR2蛋白和mRNA的表达,对VEGFR1的表达无明显影响作用;DHA下调ERKl/2,p-ERK1/2,c-fos和c-myc蛋白和mRNA的表达,抑制ERK信号通路的激活。(3)WB实验结果表明,DHA可使HUVECs细胞质中的IκB-α蛋白表达显著增加,使细胞核中NF-κBp65蛋白表达显著降低,抑制NF-κB信号通路的激活;免疫荧光结果直观表明DHA可抑制NF-κB p65的核移位来抑制NF-κB信号通路的激活。(4)双荧光素酶报告基因检测结果表明,DHA可显著降低VEGFR2启动子活性;染色质免疫共沉淀实验结果证实,DHA通过特异性减少NF-κB p65与VEGFR2启动子的结合,来降低VEGFR2启动子活性,导致VEGFR2表达降低。(5)WB和qRT-PCR实验结果表明,DHA与PDTC作用类似,通过抑制NF-κB信号通路调控VEGFR2的表达。(6)MTT实验和ECIs实时增殖实验结果表明,DHA通过抑制NF-κB和ERK信号通路调控内皮细胞的增殖能力。(7)视网膜血管的染色及可视化图像分析结果表明,DHA刺激后可使小鼠视网膜中血管密度较对照组(PBS)小鼠相比下降了 36.56%;PDTC组(0.5mM)刺激后的小鼠视网膜血管密度与对照组(PBS)小鼠相比下降了 48.23%;而PDTC+DHA 组(0.5mM+0.1mM),与 PDTC 组(0.5mM)相比,视网膜血管密度并没有呈现统计学意义的降低。体内实验证实DHA通过抑制NF-κB号通路来发挥抗血管新生作用。研究结论DHA通过抑制NF-κB信号通路,以VEGFR2蛋白为作用靶点,发挥其抗血管新生作用;DHA通过抑制ERK信号通路调控内皮细胞的增殖。研究背景随着我国工业的快速发展,重金属污染事件层出不穷,引发公众的广泛关注和担忧。镉是常见的重金属污染物之一,被美国毒物管理委员会(ATSDR)列为第六位危害人体健康的有毒物质,半衰期长达10-30年。镉具有易富集的特性,易在人体内特别是肝脏和肾脏内蓄积。镉摄入的主要途径是吸烟及误食镉污染食品。依据镉暴露的剂量大小和镉暴露的时间长短可导致不同程度的慢性镉中毒,对包括肾、肺、肝、脑、睾丸、骨豁、血液及血管等在内的多种组织和器官造成长期损伤。镉经过循环系统进入人体各个组织。血管内皮是直接接触进入人体毒素的器官。镉通过呼吸或其它途径进入人体循环系统后,以自由离子或与血浆蛋白结合形成复合体的形式存在血液循环中。血管内皮细胞是首当其冲的受害细胞,是镉的一个重要靶点。高浓度镉可直接杀伤血管内皮细胞,低浓度镉虽对血管内皮细胞的活力没有明显影响,但可导致血管屏障受损。虽然镉的毒理学研究开展很早,但大部分研究集中在长时间镉蓄积上,对一过性低浓度镉暴露损害血管内皮细胞的研究较少。血管通透性的维持主要依赖血管内皮的完整性,粘附连接在维持血管内皮细胞通透性方面起主要作用。血管内皮细胞钙粘素(VE-cadherin)与β-catenin形成连接复合体,是粘附连接的支架蛋白。VE-cadherin和β-catenin从细胞粘着连接处分离可导致内皮细胞通透性增高。p38 MAPK信号通路在调控内皮细胞通透性方面起重要作用。本研究假设重金属镉可以通过p38 MAPK信号通路调控血管内皮细胞通透性。研究目标(1)确认环境毒物氯化镉(CdCl2)对内皮细胞通透性的损害作用;(2)确认p38 MAPK信号通路在调控CdCl2诱导内皮细胞高通透性中的作用。研究方法(1)对细胞的刺激剂量梯度实验中,分别用终浓度为0,1,4,10,50和100 μnM的CdC12刺激HUVECs;时间梯度实验中,分别在刺激后的0,1,2,6,12,24和48小时进行检测。后续实验中选择终浓度为4 μ的CdC12进行刺激,刺激后24小时进行检测;为确认CdC12对p38MAPK信号通路的影响,加入终浓度为10μM的p38 MAPK信号通路抑制剂SB203850进行预刺激HUVECs 1小时,以阻断MAPK信号通路。(2)台盼蓝染色采用台盼蓝染色,不同浓度CdCl2刺激HUVECs后,分别在刺激后的24小时和48小时检测各组HUVECs的活力变化。(3)MTT实验终浓度为4 μM CdCl2刺激HUVECs后,采用MTT增殖实验,在不同时间点检测细胞的增殖能力。(4)FITC-dextran transwell将细胞分为对照组(ddH20),CdCl2组(4μM),SB203850组(10μM)和SB203850+CdCl2组(10μM+4μM),将刺激后的各组HUVECs接种于上层小室中,使用FITC-dextran,通过荧光酶标仪分析各组细胞的通透性。(5)蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)提取不同浓度CdCl2刺激后的HUVECs总蛋白质,进行凝胶电泳,转膜,一抗二抗孵育和ECL发光液曝光等步骤,检测细胞中磷酸化p38(p-p38)和p38蛋白的表达情况。(6)免疫荧光(Immunofluorescence)将细胞分为对照组(ddH2O),CdCl2组(4μM)和 SB203850+CdC12组(10μM+4 μM),各组加药后分别刺激24小时,细胞经4%多聚甲醛固定后,通过一抗二抗孵育,显微镜采集图片等步骤,直观观察各组HUVECs中VE-cadherin和β-catenin蛋白的表达和分布情况。(7)细胞电子阻抗传感系统(Electric cell-substrate impedance sensing,ECIs)细胞分为对照组(ddH20),CdC12 组(4 μM),SB203850 组(10 μM)和SB203850+CdCl2组(10μM +4μM),将HUVECs 接种于 ECIs 板中,分别给予各组刺激,通过检测不同组中细胞的实时跨细胞电阻方法检测内皮细胞通透性的变化。(8)酶联免疫吸附实验(ELISA)收集对照组(ddH20),CdCl2组(4μM)和 SB203850+CdCl2组(10μM+4μM)刺激后的HUVECs细胞培养液,利用酶联免疫方法检测各组细胞分泌TNF-α蛋白情况。(9)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)提取对照组(ddH20),CdCl2组(4μM)和 SB203850+CdC12组(10μM+4μM)刺激后的HUVECs总RNA,进行逆转录和PCR方法检测各组HUVECs中TNF-α的基因表达情况。(10)统计分析同第一部分研究结果(1)MTT和台盼蓝实验结果表明,当镉离子浓度低于4μ时,CdCl2对HUVECs的增殖能力和活力无明显影响作用;(2)Trasswell FITC-dextran通透性实验结果表明,终浓度为4 μM CdCl2可导致HUVECs通透性增高。(3)WB实验结果发现,CdC12刺激HUVECs后,细胞中p38和磷酸化p38(p-p38)蛋白的表达量明显增加,表明CdCl2刺激可激活p38MAPK信号通路。(4)ECIs通透性实验和Trasswell FITC-dextran通透性实验表明,SB203850可有效阻断CdC12诱导的内皮细胞间通透性增高现象。(5)免疫荧光实验结果发现,终浓度为4 μ镉离子能使VE-cadherin和β-catenin在HUVECs细胞膜上重新分布,有效减少细胞连接处VE-cadherin蛋白的含量;而SB203580可有效逆转镉诱导的VE-cadherin和β-catenin重新分布。表明抑制p38 MAPK信号通路可阻断镉诱导的VE-cadherin和β-catenin蛋白在细胞膜的重新定位,改善细胞通透性问题。(6)ELISA结果发现,镉刺激HUVECs后,可使细胞中TNF-α的分泌明显增加,同时qRT-PCR实验结果发现,HUVECs中TNF-α基因表达量增加;而SB203580可有效减弱镉刺激所诱导的TNF-α升高。结果表明,抑制p38 MAPK信号通路可阻断镉诱导的HUVECs中TNF-α分泌和表达。研究结论镉通过激活p38 MAPK信号通路增加HUVECs通透性,靶向抑制p38 MAPK信号通路可为镉污染相关疾病提供新的治疗方案。研究背景白细胞分化抗原CD109是一种糖基化肌醇锚定细胞表面抗原。近年来发现CD109特异性高表达于人体多种恶性肿瘤组织中,在乳腺癌和胶质瘤患者的循环内皮细胞里亦高表达。有研究表明,CD109在内皮细胞中表达降低可以促进肝细胞肝癌的血管新生和转移。血管新生在肿瘤的发生发展过程中起重要主要。但CD109在各类型肿瘤组织的血管内皮细胞中的表达还无研究。在本项研究中,我们检测了 CD109在鳞状细胞癌组织的血管内皮细胞中的表达情况。研究目标确认CD109在鳞状细胞癌血管床内皮细胞中的表达情况。研究方法(1)免疫组化(immunohistochemistry)购买正常胸腺组织芯片,购买食管、阴茎、皮肤、胆囊等器官鳞状细胞癌表达谱组织芯片,给予CD109抗体染色,确认CD109在上述组织中的表达情况。(2)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)收集新鲜阴茎鳞癌标本,提取组织总RNA,通过逆转录和RT-PCR方法检测CD109基因在阴茎鳞癌中的表达情况。(3)蛋白免疫印迹(WesternBlot)收集新鲜阴茎鳞癌标本,提取组织总蛋白质,进行凝胶电泳,转膜,一抗二抗孵育和ECL发光液曝光等步骤,确认CD109在阴茎鳞癌中的表达情况。(4)免疫荧光(Immunofluorescence)收集新鲜阴茎鳞癌组织,冰冻包埋和切片后进行CD109抗原染色,荧光二抗标记,显微镜采集图片等步骤,直观观察CD109在上述组织中的表达和分布情况。(5)统计学分析同第一部分研究结果(1)CD109在正常胸腺组织的上皮细胞中高表达,在血管内皮细胞中无表达。(2)免疫组化结果发现CD109在正常皮肤部位有微弱表达,在皮肤、食管、胆囊和阴茎部位的鳞状细胞癌的癌细胞中高表达,且与肿瘤分级呈负相关,CD109在正常皮肤和上述癌组织的血管内皮细胞中无表达。研究结论CD109在鳞状细胞癌的癌细胞中特异性高表达,且与肿瘤分级呈负相关。