背景:主动脉夹层（Aortic dissection,AD）是一种致命的大血管疾病,未经治疗的AD死亡率高达90%。AD的治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗（血管腔内修复治疗）、外科手术治疗,尽管这些治疗目前已经取得了很大的进步,AD手术的难度高、术后多脏器功能损伤、凝血功能障碍等并发症仍不能完全避免,因此,AD仍然是严重威胁生命的一种疾病,临床确诊后需要尽快进行干预。目前AD的治疗尤其是Stanford A型AD的治疗仍然是外科治疗领域的一个难题。为了探究更好的治疗方法,从分子层面阐明AD的发病机制对今后的基因靶向治疗至关重要。血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC）以增殖型或收缩型2种表型存在。它们从胚胎组织中的增殖表型转变为成年血管中的收缩表型。在健康的血管中,大多数VSMC呈现收缩表型,由于病理损伤（高血压、低氧、炎症等）的持续性刺激,大部分处于收缩状态的VSMC可以转换为增殖表型。有文献报道显示VSMC的过度增殖型表型转换被认为是AD的标志性病理改变之一,故研究VSMC表型转换有可能揭示AD的发病机制。外泌体作为细胞之间信息传递的重要信号分子载体,被报道参与诸多心血管疾病的生理病理机制。其包含有的RNA（mi RNA、circ RNA、linc RNA）、蛋白质、脂质等生物活性分子,起到了相关信号通路的调节作用。其中,外泌体携带的mi RNA是目前的研究热点,越来越多的研究表明mi RNA在细胞生长、分化、代谢、凋亡等病理生理过程中起到重要作用,并且mi RNA在基因表达的调节作用也很显著。有研究表明,部分mi RNA转染干细胞产生的外泌体,通过下调硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）基因的表达,从而部分抑制了细胞增殖。外泌体被VSMC摄取后,通过调节细胞增殖及迁移,导致内皮炎症及动脉粥样硬化的进展。因此,通过提高外泌体分泌水平或通过外源性基因改造及修饰等方法将外泌体结合到VSMC中,可能有助于抑制其过度增殖,延缓AD的发病及进展,从而起到分子靶向治疗的作用。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）外泌体因为易获得性,以及MSC的多向分化、较强自我更新能力等特点,一直是临床基因靶向治疗的研究热点。诸多研究报道表明,MSC具有调节炎性反应、免疫抑制等多方面生物功能作用。近年研究显示,MSC的治疗作用主要是依靠其旁分泌功能,而MSC旁分泌的物质主要为外泌体等,利用外泌体为药物载体来发挥治疗作用。综上,我们提出科学假设:MSC外泌体被VSMC摄取后,可能通过抑制其过度增殖型表型转换,同时抑制VSMC的增殖和迁移,达到对AD的分子靶向治疗作用。本实验拟通过建立VSMC过度增殖型表型转换的体外细胞模型,探究MSC外泌体对VSMC增殖型表型转换及增殖和迁移等方面的影响,初步探讨其抑制VSMC过度增殖型表型转换,抑制异常增殖与迁移的分子机制,为进一步开发和应用MSC外泌体在AD分子靶向治疗中的应用奠定理论基础。目的:主动脉中层VSMC过度增殖型表型转换是AD发生的重要因素,作用机制尚未完全阐明。VSMC表型转换是影响细胞增殖和迁移的重要因素之一。外泌体被报导可抑制黏附分子表达和氧化应激,维持正常脂质代谢的作用,但是其在主动脉中层VSMC增殖型表型转换方面的研究报道较少。本实验拟研究mi R-638/Sp1轴通过调控EMT信号通路对主动脉夹层VSMC增殖型表型转换的作用,探究MSC外泌体对VSMC增殖型表型转换的治疗作用。通过应用MSC外泌体,抑制VSMC过度增殖型表型转换,抑制动脉中层细胞增殖和迁移,从而对AD的治疗起到帮助,甚至一定程度上可以预防AD的发生。方法:1.根据前期基因芯片及生物信息学分析,初步筛选差异表达的mi RNA,并确定目标mi RNA为mi R-638,targetscan（http://www.targetscan.org/）数据库筛选与mi R-638有结合位点的靶基因（Sp1）。搜集AD与非AD升主动脉组织标本,行HE染色及免疫组化,提取RNA后进行PCR及Western Blot等验证mi R-638及Sp1的差异性表达。2.应用血管紧张素II（Angiotensin II,AngⅡ）建立VSMC增殖型表型转换的体外细胞模型。设置浓度梯度分别为0.1umol/L、0.5umol/L、1.0umol/L、1.5umol/L、2.0umol/L,设置时间梯度分别为6小时、12小时、18小时、24小时、36小时,通过利用不同浓度/不同时间的AngⅡ处理VSMC,应用PCR、Western Blot、CCK-8、Transwell、划痕实验、Ed U等实验方法检测VSMC的表型转换及增殖和迁移情况,确定AngⅡ促进VSMC过度增殖型表型转换的最适浓度及最适时间,并以此建立后续研究中VSMC的体外细胞模型。3.探究MSC外泌体对VSMC表型转换的影响。本研究利用MSC外泌体与VSMC共培养,通过PCR、Western Blot、Transwell、CCK-8等方法验证MSC外泌体对VSMC过度增殖型表型转换及增殖和迁移的影响。利用差速离心法收集MSC上清中的外泌体,通过电镜及Western Blot等方法验证外泌体的特征。在体外细胞模型中,分别对VSMC给予MSC外泌体进行处理,应用PCR、Western Blot、CCK-8、Transwell检测细胞增殖型表型转换及增殖和迁移情况,验证MSC外泌体对主动脉夹层VSMC过度增殖型表型转换及过度增殖迁移的抑制作用。4.探究mi R-638/Sp1调控EMT信号通路对VSMC增殖型表型转换的作用。通过基因芯片分析选取mi R-638为目标mi RNA。利用RNA转染技术（lipo3000）,在体外细胞模型中,对VSMC转染mi R-638 mimics和干扰物,检测mi R-638及Sp1的表达量变化,同时通过转染Sp1质粒及干扰物,进行补救实验,利用q PCR、Western Blot等方法检测VSMC增殖型表型转换,CCK-8、Ed U实验、Transwell、划痕实验等检测细胞的增殖和迁移情况。同时通过双荧光素酶实验进一步验证mi R-638与Sp1的结合位点。5.确定MSC外泌体中含有mi R-638,并验证其对VSMC增殖型表型转换的作用。提取MSC外泌体中的mi RNA,应用PCR等方法检测外泌体mi RNA中含有mi R-638。对MSC转染mi R-638 mimics和干扰物,将处理后的MSC外泌体分别与VSMC体外细胞模型进行处理,利用q PCR、Western Blot等方法检测VSMC的增殖型表型转换,CCK-8、Ed U、Transwell、划痕实验等检测细胞的增殖和迁移情况。6.构建动物模型,皮下注射Ang II诱导VSMC过度增殖,尾静脉注射MSC外泌体,通过HE染色、免疫组化、PCR及Western Blot等多种方法,检测VSMC增殖型表型转换及细胞增殖情况,进一步验证体外实验结果。结果:1.获得AD患者（非遗传性）术中切除的升主动脉破口周围组织作为实验组,冠脉搭桥手术患者术中升主动脉吻合时切除的主动脉组织作为对照组,HE染色及免疫组化可见实验组组织排列紊乱,增殖明显。PCR及Western Blot结果显示,AD中mi R-638表达降低,Sp1表达升高。2.1 umol/L Ang II诱导VSMC 24小时可以最大程度的促进VSMC增殖、迁移,并促进VSMC增殖型表型转换,结果稳定,可作为后续检测以及分子生物学实验的诱导条件。3.MSC外泌体对VSMC表型转换的作用。利用差速离心法收集MSC外泌体,通过电镜及Western Blot方法确认外泌体特征。在Ang II诱导的体外细胞模型中,加入MSC外泌体共培养,通过对VSMC表型转换标志物的检测发现,随着外泌体加入,细胞模型中SMA、MYH11、SM22、CAL标志物水平升高,结合CCK-8及Transwell、划痕实验等结果显示,细胞增殖、迁移能力有所下降,说明VSMC的过度增殖型表型转换及增殖迁移能力被抑制。4.mi R-638/Sp1调控EMT信号通路对VSMC表型转换的作用。在组织标本及血液外泌体标本中,mi R-638均表达下降;在Ang II诱导的体外细胞模型中,用RNA干扰技术分别过表达和敲低VSMC中的mi R-638发现,随着mi R-638表达量下降后,细胞模型中SMA、MYH11、SM22、CAL标志物水平降低,细胞增殖型表型转换更为显著;结合CCK-8及Transwell、划痕实验等结果显示,mi R-638低表达时,细胞增殖、迁移能力增强,说明VSMC的增殖能力及增殖型表型转换被促进,上述现象可以通过Sp1低表达补救逆转。同样,mi R-638过表达时,VSMC的增殖型表型转换被抑制,结果可被Sp1过表达逆转补救。在对EMT信号通路的相关蛋白检测中,mi R-638低表达时,Vimentin、N-cadherin表达量升高,而E-cadherin表达量下降,该结果可被Sp1低表达逆转;mi R-638过表达时,结果相反,该结果可被Sp1过表达补救。双荧光素酶试验证实,mi R-638与Sp1具有可结合性。因此,mi R-638/Sp1通过调控EMT信号通路对VSMC的增殖及增殖型表型转换有抑制作用。5.提取MSC外泌体中的mi RNA,PCR检测外泌体中含有mi R-638。将转染mi R-638 mimics及干扰物的MSC外泌体与细胞模型共培养后发现,当共培养mi R-638高表达的MSC外泌体时,细胞模型中SMA、MYH11、SM22、CAL标志物水平升高,当共培养mi R-638低表达的MSC外泌体时,细胞模型中的标志物水平无明显变化,结合CCK-8、Transwell、划痕实验等结果,进一步说明MSC外泌体是通过其携带的mi R-638来对VSMC的增殖能力及增殖型表型转换起到作用。6.通过动物实验,结合免疫组化及PCR、Western Blot等结果,同样在注射了Ang II的VSMC过度增殖的动物模型中,注射MSC外泌体后,VSMC增殖型表型转换作用明显被抑制,SMA、MYH11、SM22、CAL标志物水平升高,进一步证实MSC外泌体mi R-638对Ang II处理的VSMC过度增殖型表型转换及细胞增殖迁移的抑制作用。结论:1、AD患者升主动脉中层VSMC发生了过度增殖型的表型转换。2、Ang II在1umol/L条件下诱导VSMC 24小时,以此为条件模拟AD患者升主动脉VSMC增殖型表型转换细胞模型最为合理。3、MSC外泌体可以减轻甚至一定程度上逆转AD中VSMC过度增殖型表型转换,抑制VSMC过度增殖及迁移。4、mi R-638/Sp1通过调控EMT信号通路对主动脉夹层VSMC过度增殖型表型转换及过度增殖迁移有抑制甚至逆转作用。5、MSC外泌体中含有mi R-638,被VSMC摄取后通过mi R-638/Sp1轴实现其对主动脉夹层VSMC过度增殖型表型转换及过度增殖迁移的抑制作用。6、体内实验证实,MSC外泌体mi R-638对主动脉VSMC增殖型表型转换有抑制作用。综上,AD患者中,VSMC mi R-638表达减低,减少了与Sp1的结合,从而使VSMC增殖型表型转换能力增加,增殖和迁移能力增强,MSC外泌体mi R-638通过mi R-638/Sp1轴调控EMT信号通路,抑制了VSMC过度增殖型表型转换,同时降低了VSMC增殖和迁移能力。本项研究结果为MSC外泌体mi R-638/Sp1轴调控EMT信号通路在AD分子靶向治疗中的应用提供了新的理论基础,同时为AD药物治疗靶点提供了新的思路及研究方向。