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马铃薯Y病毒属是植物病毒中最大的一个属,包括马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)等,对世界范围内的经济作物造成的产量和经济损失严重。PVY存在着明显的株系分化现象,在寄主与病原相互作用中,且随着抗病品种等的应用,新的株系将会不断出现。RNA介导的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance, RMVR)是近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略,具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久、生物安全性高等优点。RNA介导的抗性也存在着一定的局限性,即抗性谱较窄,但这种局限性可以用同时表达多个不同的病毒RNA序列所弥补,所以可以把不同病毒的有效核酸片段连接起来转化植物,获得多抗植株。在前期的研究中,我们对CP基因在RNA水平上介导的病毒抗性进行了深入系统地研究,并且发现CP基因的3’端和5’端序列介导的病毒抗性存在显著差异。基于生产中存在的问题和本实验室的研究基础,本研究的第一个内容用马铃薯Y病毒的复制酶基因(nuclear inclusion b, NIb)的保守序列作为转基因材料,探讨核苷酸序列同源性与RNA介导的病毒抗性产生的关系,以及利用同源片段培育多抗病毒(株系)的可能性,研究结果为进一步阐明RNA介导基因沉默(病毒抗性)产生的机制,及利用该策略培育多抗病毒(株系)转基因植物提供依据。第二个内容是用马铃薯Y病毒NIb基因不同位置51bp长度片段构建反向重复转基因结构,探讨NIb基因不同位置的cDNA区段对RNA介导病毒抗性的影响,本研究结果对于有效地选择靶位点序列和成功应用RNA介导的病毒抗性策略,具有重大指导意义,研究结果和主要结论如下:根据已克隆的PVY-SD1 NIb的全长cDNA序列(1557bp)序列设计了5段保守序列基因片段的特异引物,以PVY-SD1NIb的cDNA为模板,进行PCR扩增,得到相应的基因扩增产物,双酶切纯化后,与用相同酶处理的pROKII连接,热激法转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得重组表达质粒PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ。酶切鉴定表明成功构建了植物表达载体。将成功构建的植物表达载体利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89。再生植株经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,结果表明,转化PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ分别获得168、150、166、155和170株T0代转基因植株。5种转基因烟草分别接种PVY 3个分离物和TEV-SD1分离物后,发现:5个转基因株系PRIR-Ⅰ、PRIR-Ⅱ、PRIR-Ⅲ、PRIR-Ⅳ和PRIR-Ⅴ接种分离物PVY-SD1,转基因植株中抗性植株的比例分别为26.4%、22.6%、36%、20.2%和21.7%;接种分离物PVY-SD5,除了转基因株系PRIR-Ⅳ(84.3%)未获得抗性植株外,其余4个转基因株系(PRIR-I、II、III、V)中抗性植株的比例分别为2.5%、3.0%、15.6%和4.3%;接种PVY-SD4和TEV-SD1则全部感病。结果显示:当转基因与病毒RNA序列间的同源性为100%-90.2%时,均可介导对病毒的抗性;同源性等于或低于88.2%时,则不能介导病毒抗性的产生。表明转基因与病毒RNA序列间高度的同源是抗性产生所必需的,最低同源性在90%左右。同时发现,抗性与同源性并不呈完全正相关。表明区段的位置或序列对RNA介导的病毒抗性产生也有影响。为了分析转基因的拷贝数与抗病性的关系,对获得的抗病转基因植株和部分感病转基因植株进行Southern杂交分析,结果表明,外源基因已整合到烟草基因组中,且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性。转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关;抗病转基因植株中有siRNA存在,表明病毒抗性是由RNA介导的。根据已克隆的PVY-SD5 NIb的全长cDNA序列(1557bp)设计了5个不同位置,5′端(nt1-51)、5′端1/2(nt364-414)、中间(nt753-803)、3′端1/2(nt1143-1193)和3′端(nt1507-1557)基因片段的特异引物,以PVY-SD5 NIb的cDNA为模板,进行PCR扩增,得到51bp的基因扩增产物。将扩增产物双酶切后,用T4DNA连接酶于16℃体外连接,热激法转化大肠杆菌DH5α。筛选并获得重组表达质粒pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ。酶切鉴定表明成功构建了植物表达载体。将成功构建的植物表达载体利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89。转化pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ的转基因植株经卡那霉素筛选和PCR检测,分别获得61、58、64、67和56株T0代转基因植株。转基因植株的抗病性分析表明:PVY NIb基因不同位置cDNA区段介导的对PVY的抗性存在显著差异,转pRIR-NIbⅠ、pRIR-NIbⅡ、pRIR-NIbⅢ、pRIR-NIbⅣ和pRIR-NIbⅤ株系中,抗病植株的比例分别为31.15%、10.34%、51.56%、67.16%和16.07%。通过对转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关;抗病转基因植株中有siRNA存在,表明病毒抗性是由RNA介导的。