背景由感染、创伤、肿瘤导致的大段骨缺损一直是创伤外科领域最严重的并发症之一,也是骨科医师面临的棘手问题。自2000年Masquelet首先报道膜诱导技术后,引起学者的日益重视,并越来越多的应用于临床研究。近年的研究表明,诱导膜是在骨水泥周围形成的血运丰富的纤维样结构,具有减少移植骨吸收、促进血管生成和松质骨皮质化的作用,膜诱导技术治疗大段骨缺损,临床效果稳定可靠。膜诱导技术二期取出骨水泥,需要在骨缺损处植骨重建,选择自体骨移植是治疗骨缺损的金标准,但对于成人的大段骨缺损,自体松质骨数量往往难以满足要求,因此,自体骨源有限是制约膜诱导技术修复大段骨缺损的主要瓶颈,并且存在供区疼痛、成骨能力不足、疤痕、感染、失血等并发症。部分学者寻求使用或增加自体骨替代物用量,来弥补自体骨源的不足。目前认为,自体松质骨移植可以部分的被同种异体松质骨替代,但不应超过总量的1/3,因为移植物内不包含干细胞和生长因子。因此,能否增加骨替代物的使用比例,以及如何通过干细胞迁移,来促进诱导膜技术中骨替代物的成骨和血管化,将是重要的研究方向。本研究首先通过构建大鼠诱导膜骨缺损模型,结合人工材料植入,研究诱导膜对植入材料成骨基因表达的调节作用,以探讨未来应用人工材料结合膜诱导技术修复骨缺损的可能性。其次,骨替代物临床应用面临的难点,最主要的是移植后不能快速建立血运,不能提供营养成分和排出代谢产物,影响了宿主具有成骨作用的干细胞的募集,因此,如何尽快重建局部的血运,这是骨替代物能够顺利骨重建的基础。EPCs具有维持血管内环境稳定的重要生理作用,并在骨缺损部位调节血管新生,促进血管生成,提高人工骨移植的成活率。因此,我们研究了骨保护素(OPG)改善骨缺损部位EPCs的活性、增强EPCs的迁移功能、促进EPCs形成新生血管的作用,为人工骨的顺利血管化和成骨提供了新思路。第三,在诱导膜技术修复骨缺损过程中,骨髓间质干细胞(BMSCs)等参与了移植骨的成骨过程。有学者在多种骨缺损动物模型中证实,MSCs结合EPCs可以显著促进骨愈合过程,但启动宿主BMSCs向缺损部位迁移的机制不清楚。既往研究表明诱导膜中基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的表达量显著增高。SDF-1是众所周知的由骨髓基质细胞和其他基质细胞分泌的趋化蛋白,CXCR4是SDF-1的跨膜受体,表达在间充质干细胞(MSCs)和BMSCs的表面。SDF-1及其受体CXCR4通过组织和血液中的SDF-1浓度梯度,在造血干细胞的激活和调控BMSCS迁徙方面发挥重要作用。因此,本课题拟通过Transwell实验和动物实验,研究诱导膜形成及修复骨缺损过程中,SDF-1对BMSCs的迁移作用,以了解诱导膜形成的机制,以及诱导膜形成后,BMSCs参与移植骨骨重建的迁移机制,以探讨诱导膜技术中促进BMSCs迁移和移植骨重建的机制。另外,成骨细胞在移植骨的新骨形成方面发挥重要作用。目前已经发现在骨的生物学领域,一些LncRNA可通过多种机制调控骨组织的细胞功能,参与骨骼疾病的某些病理过程。截至目前,关于Lnc RNA在骨形成和重建中作用的研究,主要集中在BMSC和成骨细胞上。因此,我们又通过干预LncRNA UCA1(尿上皮癌相关1),研究其对成骨细胞的增殖和成骨相关基因表达的影响,研究其在骨缺损修复中的作用和可能的调节机制,为创造诱导膜内骨替代物移植后的成骨微环境和防止骨吸收,提供新手段。方法:1、诱导膜技术结合不同生物材料促进成骨基因表达的研究制作生物材料双相磷酸钙(BCP)、氧化海藻酸钠-海藻酸钠(OSA-SA)、氧化海藻酸钠-海藻酸钠-羟基磷灰石(OSA-SA-HA)支架。构建大鼠诱导膜模型,HE和Masson染色观察诱导膜形成情况。诱导膜下股骨钻孔,分别植入BCP、OSA-SA、OSA-SA-HA支架材料,术后1、6、9周取材,RT-PCR检测Runt相关转录因子2(Runx2)、骨形态蛋白-2(BMP-2)、胶原1(Col-I)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)成骨基因表达情况,了解诱导膜对生物材料的成骨作用,Western blotting检测第1周p-ERK和ERK的表达,并对p-ERK/ERK的结果进行定量分析,了解诱导膜发挥成骨作用的机制。2、诱导膜技术中促进移植骨的血管化机制研究体外培养人外周血EPCs,OPG和CXCR4受体阻滞剂(AMD3100)和PI3K受体阻滞剂(Ly294002)预处理后,使用细胞划痕试验和Transwell试验,我们评估了OPG对EPCs迁移的影响,通过Western blot检测CXCR4及下游p-AKT蛋白表达,研究OPG调节EPCs的作用机制。通过制作大鼠诱导膜合并骨缺损模型,植入骨替代物BCP,并给予OPG处理4周后,通过Micro-CT及HE和Masson染色对骨缺损修复情况进行评估。然后,免疫组化染色检测EPC标记物和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的表达,用免疫荧光染色对骨缺损区域血管生成进行评估。3、诱导膜技术中促进BMSCs迁移的机制研究体外培养大鼠BMSCs,通过Transwell实验,研究SDF-1诱导BMSCs体外迁移的最佳作用浓度,并研究CXCR4受体阻滞剂AMD3100对BMSCs迁移的影响。通过动物实验制作诱导膜模型,并在诱导膜形成后,进行膜内植入骨替代物BCP,DIR标记BMSCs,注射入动物模型,用活体成像技术研究诱导膜形成过程中,和诱导膜内植骨后,BMSCs在大鼠体内的示踪效应,了解BMSCs向植骨区域迁移情况,探讨BMSCs在诱导膜形成和促进成骨的可能迁移机制。4、部分促进成骨细胞的增殖和分化机制研究收集52例住院患者和30例健康体检者血清样本,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测LncRNA UCA1在骨质疏松患者和健康受试者中的表达水平。利用小干扰RNA(si RNA)构建稳定敲除UCA1的大鼠成骨细胞MC3T3-E1。利用细胞计数Kit-8(CCK-8)检测UCA1敲除对成骨细胞增殖的影响,利用Ed U染色检测对照组和UCA1敲除组成骨细胞中Ed U阳性细胞的比例。RT-PCR检测Runx2、胶原1α1(Col 1α1)、OCN、OPG、骨桥蛋白(OPN)、Osterix(OSX)等差异相关基因的mRNA水平,Western blotting检测Runx2蛋白水平。此外,成骨细胞在培养基中培养21天,然后通过茜素红染色(alizarin red staining)和碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining,ALP)检测其成骨分化情况。最后,利用Western blotting分析骨形态发生蛋白2(BMP-2)/(Smad1/5/8)信号通路的表达,了解LncRNA UCA1敲除后促进成骨细胞增殖和分化的作用机制。结果:1、诱导膜动物模型构建后,诱导膜内植入不同材料,RT-PCR检测不同时间段成骨基因的表达,结果显示,BCP组在第1周的Runx2表达量提高明显,而第1周时OSA-SA-HA组的BMP-2具有最高表达量。在COL-I表达方面,BCP组的表达量在三个时间节点均最高;在ALP表达方面,在第6周,BCP组与OSA-SA组均达到最高值;在第9周,三组的ALP表达量均高于Blank组,OSA-SA组最高;在OCN的表达量方面,BCP组第6周达到最大值。说明在诱导膜存在的条件下,BCP组填充支架显示出更好的骨诱导活性,能够在各成骨时序点上明显的上调Runx2,Col-I,ALP和OCN的表达量。在诱导膜技术修复骨缺损时,ERK1/2信号通路也能够良好发挥调控成骨相关基因表达的作用,从而促进骨重建。2、在细胞划痕实验和迁移实验中,各组间EPC水平的差异,均显示OPG处理组促进细胞迁移,AMD3100和LY294002组则抑制OPG的迁移功能。OPG处理的内皮祖细胞CXCR4和p-AKT水平升高,说明OPG通过CXCR4信号通路对EPCs发挥调节作用。构建诱导膜骨缺损模型,用OPG处理后,免疫组化、免疫荧光染色和Micro-CT提示OPG能促进大鼠骨缺损的血管生成和骨修复,AMD3100和LY294002能消除这些作用。说明在诱导膜存在情况下,OPG可以促进EPCs迁移到植骨区,并通过CXCR4通路发挥血管化的作用,促进新生血管形成和骨修复。3、体外培养条件下,100 ng/m L SDF-1浓度时,诱导BMSCs细胞迁移效应最显著,加入SDF-1抑制剂AMD3100后,迁移细胞数量明显减少,说明SDF-1通过SDF-1/CXCR4轴以浓度梯度方式诱导BMSCs迁移。构建大鼠诱导膜形成模型和诱导膜内植骨模型,DIR碘化物标记BMSCs,不同时间段进行活体成像,可见骨水泥组(诱导膜形成组)和诱导膜内植骨组BMSCs向手术区域迁移;用AMD3100处理后仅少量BMSCs细胞向手术部位聚集,说明手术部位具有较高浓度SDF-1,并且诱导BMSCs参与诱导膜形成,以及诱导膜内植骨后的成骨过程。4、大部分骨质疏松患者血清LncRNA UCA1表达明显升高,我们推测UCA1可能参与了骨质疏松的发病机制,即该因子可能具有促进骨吸收、抑制新骨形成的作用。为了深入研究UCA1在成骨细胞中的作用,我们构建了UCA1敲减的MC3T3-E1细胞。CCK-8检测和EdU染色显示UCA1 si RNA组成骨细胞的增殖活性明显高于对照组(p<0.05),说明抑制UCA1后细胞的增殖能力显著增强。RT-PCR实验表明,UCA1 siRNA组Runx2、Collagen1a1、OC、OPG、OPN、OSX在m RNA水平高于对照组(p<0.05),说明UCA1 siRNA组细胞成骨分化能力明显增强,ALP染色和茜红素染色也证实UCA1 siRNA组细胞成骨分化能力增强。此外,通过Western blotting检测各组BMP-2、磷酸化Smad1/5/8和总Smad1/5/8蛋白表达水平,显示UCA1敲除后成骨细胞中BMP-2/(Smad1/5/8)信号通路显著激活。结论:1、在诱导膜存在的条件下,BCP组填充支架显示出更好的骨诱导活性,能够在各成骨时序点上明显的上调Runx2,Col-I,ALP和OCN的表达量。说明诱导膜结合生物材料,可以起到促进成骨的作用,有望在未来替代自体骨移植。2、在诱导膜结合BCP存在情况下,OPG通过CXCR4信号通路,可以诱导EPCs细胞迁移到骨缺损区域,促进新生血管生成,实现移植骨的血管化,从而有助于新骨形成,增强移植骨的重建能力。3、体外实验表明SDF-1可以通过SDF-1/CXCR4轴诱导BMSCs迁移。动物活体成像实验发现BMSCs可以大量迁移到手术区域,说明手术区域有大量SDF-1因子,BMSCs被SDF-1募集到手术区域,参与了诱导膜的形成,以及诱导膜内植骨的骨重建过程。4、针对诱导膜内植入骨替代物后成骨不良的情况,可以通过激活成骨细胞中BMP-2/(Smad1/5/8)信号通路,敲减Lnc RNA UCA1促进成骨细胞的增殖,促进成骨相关基因的表达。因此,UCA1有望成为骨移植后促进新骨形成、抑制骨吸收新的治疗靶点。