胃癌中lncRNA LATS2-AS1-001和邻近基因LATS2的表达及其临床病理意义

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:furong99bb
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目的:已有大量的研究表明,lncRNAs(long non-coding RNAs)作为一种长度大于200个核苷酸单位的非编码保守序列,可在肿瘤细胞的表观遗传、转录水平及转录后水平等方面发挥重要的调控作用。LncRNA LATS2-AS1-001属于LATS2(thelarge tumor suppressor)基因的反义RNA,它可能与LATS2基因以某种方式结合,从而调控LATS2的结构和功能。因此,本研究收集新鲜人胃癌组织及配对非癌组织为标本,主要采用qRT-PCR(real time-polymerase chain reaction)技术手段检测lncRNALATS2-AS1-001和邻近基因LATS2在mRNA水平的表达情况,利用Western Blot技术检测基因LATS2在蛋白水平的表达情况,分析两者在胃癌组织中的表达相关性,并评估两者的表达与临床病理因素之间的关系,探究二者可能在胃癌中的作用和意义。  材料与方法:1、收集中国医科大学第一附属医院肿瘤外科手术切除胃癌组织(GC)357例,配对非癌(距癌灶边缘大于5cm处)胃粘膜组织357例。新鲜组织标本在切取后迅速放入液氮冷藏,随后置于-80℃超低温冰箱储存以提取组织总RNA。收集患者的临床病理信息,包括年龄、性别、肿瘤大小、Lauren分型、WHO分型等,TNM分期依据国际抗癌联盟UICC(Union for International Cancer Control)/美国联合癌症委员会AJCC(American Joint Committee on Cancer)胃癌TNM分期标准(第7版),T表示原发肿瘤的浸润深度,N表示淋巴结转移情况,M表示远处转移情况;  2、设计合成lncRNA LATS2-AS1-001和LATS2的qRT-PCR引物序列,并通过BLAST在线软件确定与其他基因无同源性;  3、采用EASYspinPlus组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取组织中的总RNA,并使用Prime Script RT reagent Kit试剂盒对其进行反转录。应用qRT-PCR技术检测胃癌组织及配对非三癌组织中lncRNA LATS2-AS1-001和LATS2的表达;  4、提取人胃癌及非癌胃粘膜组织中的总蛋白,应用Wstern Blot技术检测基因LATS2的蛋白水平表达;  5、实验结果采用SPSS17.0(SPSSInc,Chicago,IL,USA)统计学软件进行统计学处理和分析,使用Graphpad prism5制图软件绘制受试者工作曲线(receiveroperating characteristic curve,简称ROC曲线)及相对表达量散点图。根据最佳约登指数(Youden index)、阳性似然比(positive likelihood ratio)及敏感性(sensitivity)和特异性(specificity)的位点取截断值(cutoff value),并求出曲线下面积(area undercurve,AUC),AUC在0.5到1.0之间可认为具有诊断效能。在AUC>0.5的情况下,AUC越接近于1,说明其诊断价值越高。当lncRNA LATS2-AS1-001或LATS2在胃癌中的相对表达量≥cutoff,即可认为lncRNA LATS2-AS1-001或LATS2在胃癌中呈高表达水平。胃癌组织和非癌组织中lncRNA LATS2-AS1-001和LATS2的相对表达量采用均数±标准差表示。高表达组和低表达组的统计学差异采用配对t检验法,与胃癌患者的临床病理因素的分析采用行×列表的x2检验,以α=0.05为检验水准。  实验结果:1、LncRNA LATS2-AS1-001的表达:mRNA水平lncRNALATS2-AS1-001在人胃癌组织中的相对表达量(0.04±0.068)显著低于非癌组织(0.07±0.100),P<0.001;在人胃癌细胞系中,lncRNA LATS2-AS1-001的相对表达量由高到低依次为:HGC-27>MKN-45>MGC-803>GES-1>BGC-823>NCI-N87>SGC-7901;  2、LncRNALATS2-AS1-001的ROC曲线中AUC=0.7274,p<0.001,表明LncRNA LATS2-AS1-001在临床上具有潜在应用价值;  3、在不同性别、年龄、肿瘤大小等基线因素相关的患者中,lncRNALATS2-AS1-001的表达未见统计学差异,P>0.05;且lncRNA LATS2-AS1-001的表达与胃癌大体分型、WHO组织学分型、Lauren分型等临床病理因素不相关,但与TNM分期相关,P=0.032;  4、基因LATS2 mRNA水平的表达:LATS2在人胃癌组织中的相对表达量为0.07±0.093,在非癌胃粘膜组织中的相对表达量为0.12±0.114,二者的表达具有统计学差异,P<0.001;在人胃癌细胞系中,LATS2的相对表达量由高到低依次为:HGC-27>MKN-45>MGC-803>GES-1>BGC-823>NCI-N87> SGC-7901;  5、基因LATS2蛋白水平的表达: LATS2在人胃癌组织中的相对表达量为1.17±0.77,在非癌胃粘膜组织中的相对表达量为1.41±0.85,二者的表达具有统计学差异,P=0.027;  6、LATS2的ROC曲线中AUC=0.6865,p<0.001,表明LATS2在临床上具有潜在应用价值;  7、对相关临床病理资料统计分析结果显示,LATS2的表达与胃癌患者的TNM分期相关,P=0.047,差异有统计学意义,但在不同性别、年龄、肿瘤大小、胃癌大体分型、WHO组织学分型、Lauren分型等的胃癌患者中LATS2的表达差异未见统计学意义;  8、LncRNA LATS2-AS1-001和基因LATS2的相关性:lncRNA LATS2-AS1-001和LATS2在人胃癌组织中的表达呈正相关(r=0.719),P<0.001。  结论:1、LncRNA LATS2-AS1-001和LATS2在胃癌中低表达,其表达与胃癌患者的TNM分期有关,但与其他临床病理因素无明显相关;  2、ROC曲线分析两者的AUC>0.5,可能具有一定诊断价值;  3、LncRNALATS2-AS1-001和LATS2 mRNA水平在人胃癌组织中的表达呈正相关,前者可能与LATS2特异性结合形成特殊的复合物,增加其稳定性,使原本应该降解的部分减少,从而增加其表达量,最终直接或间接地参与调节LATS2的表达和功能,影响胃癌的发生发展过程。
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