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本研究利用山羊诱导多能干细胞(giPSCs-like)为实验材料,筛选能够促进giPSCs多能性状态维持的小分子化合物,从而优化培养体系。再对优化后的培养体系下获得的giPSCs进行一系列生物学特性检测,同时结合RNA-seq技术和生物信息学分析,探究其促进多能性维持的相关分子机制。1.促进山羊iPSC-like细胞多能性的培养条件筛选(1)通过比对添加单个作用于表观遗传的小分子药物对giPSC-like细胞的影响,以克隆形态,碱性磷酸酶活性以及相关基因的表达量作为鉴定指标,结果发现:Vc组与RG108组可以明显促进克隆的生长速度与维持克隆形态,克隆更加透亮,碱性磷酸酶(AP)活性增强。同时添加Vc组显著提高了组蛋白去甲基化酶KDM2B和DNA去甲基化酶TET1,TET3的表达。添加RG108组降低了 DNA甲基转移酶抑制剂(DNMT1)的表达。(2)进一步筛选小分子组合,结果发现:Vc与RG108(即VR)组合使用时,AP活性更强,同时显著上调TET1,TET3和显著下调DNMT1的表达。另外多能性基因OCT4,SOX2,NANOG的表达量也显著提高,促进多能性的维持。(3)筛选基础培养基发现:DMEM/F12+10%FBS+10%KSR(DFK)的基础培养基明显提高克隆的生长速度和质量,QRT-PCR结果显示该基础培养基结合VR培养细胞时,OCT4,KLF4,NANOG,TET1表达量上调最显著。最终在此基础上完善培养基,发现添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进一步促进克隆增殖速度和显著上调相关基因表达量,从而确定“DFK-VR+bFGF”(DMEM/F12+10%FBS+10%KSR+DOX+β-巯基乙醇+L-谷氨酰胺+ NEAA+Vc+RG108+bFGF)为优化后的培养体系。(4)“DFK-VR+bFGF”培养体系下获得的giPSCs进行生物学鉴定和无DOX条件培养。结果显示:giPSCs克隆圆润透亮,形态聚拢,呈现山羊正常的染色体核型,共60条染色体。与对照组相比,克隆生长速度快,AP活性强。相对荧光强度结果显示:H3K9me3的荧光强度显著降低,多能性基因SOX2和NANOG的荧光强度显著提高。无DOX培养条件下,“DFK-VR+bFGF”培养体系中能够在一定程度上维持克隆形态。2.山羊iPSC-like细胞在“DFK-VR+bFGF”以及对照组(GIPS)培养体系下转录组测序分析比较根据测序结果,分析“DFK-VR+bFGF”与GIPS两个体系下差异基因显著富集的KEGG通路,找到造成两组多能性差异的关键信号通路,包括有 Wnt signaling pathway,Hippo signaling pathway,PI3K-AKT signaling pathway等。发现激活Wnt信号通路有利于多能性的提升,激活PI3K-AKT信号通路会促进细胞增殖、抑制凋亡和促进糖原生成过程。Hippo信号通路对于有助于giPSCs的增殖、存活和多能性的维持至关重要。综上,我们筛选获得可促进giPSCs多能状态维持的培养体系“DFK-VR+bFGF”,推测该体系可能是通过小分子化合物Vc和RG108降低细胞整体甲基化,从而促进多能性的提升,同时激活了Wnt信号通路,Hippo信号通路和PI3K-AKT信号通路发挥重要作用。上述结果为山羊多能干细胞培养条件的进一步优化提供一定的理论基础,也为促进转基因动物生产以及畜牧业发展奠定基础。