目的1.研究褪黑素(Melatomin, MLT)对慢性应激加高脂饲料诱导的糖耐量减低大鼠模型糖脂代谢的初步作用；2.研究MLT对慢性应激加高脂饲料诱导的糖耐量减低大鼠模型糖脂代谢的药效学影响；3.研究MLT改善慢性应激加高脂饲料诱导的糖耐量减低大鼠模型糖脂代谢的初步作用机制；4.研究MLT改善慢性应激加高脂饲料诱导的糖耐量减低大鼠模型糖脂代谢的分子作用机制；5.探讨长期血糖平均水平不同的2型糖尿病(Type2diabetes mellitus, T2DM)患者下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)轴激素与MLT的关系,了解褪黑素水平在糖尿病不同发病进程中的变化。方法基子HPA轴调节的褪黑素对慢性应激大鼠糖代谢的影响：1.大鼠分组、造模及给药：根据体重随机分为正常对照组,糖耐量减低模型组,糖耐量减低+阳性药物阿米替林组(AMI,6mg·kg-1·d-1),糖耐量减低+MLT低剂量(MLT-L,10mg·kg-1·d-1)组、糖耐量减低+MLT中剂量(MLT-M,20mg-kg-1·d-1)组、糖耐量减低+MLT高剂量(MLT-H,40mg·kg-1·d-1)组。除正常组外,其余组给予高脂饲料喂养。造模同时灌胃给药,正常组、模型组每日给予等量生理盐水。每天给药1h后,除正常组外,每组给予一种随机应激方式(细绳悬尾30min; PVC筒固定2h；纱布束缚2h；大鼠固定架固定2h),连续应激7周。每天定时记录大鼠摄食量、饮水量；每周测定大鼠体重、空腹血糖(Fastingplasma Glucose, FPG),给药4、7周后进行腹腔糖耐量试验(Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, IPGTT)。连续给药7周后大鼠禁食不禁水6h后断头处死并收集躯干血。取大鼠脏器,测定大鼠脏器指数；检测1、4、7周血浆空腹胰岛素(Fasting Plasma Insulin, FINS)、CORT、CRH与ACTH水平；造模第4周的TG、TC、 HDL-C、LDL-C的含量；取大鼠肝脏与肌肉,测定肝糖原及肌糖原的含量。2.大鼠分组、造模及给药同前,阳性药物氟西汀组(FLU,10mg·kg-1·d-1),每天定时记录大鼠摄食量、饮水量；每周测定大鼠体重、FPG,给药2、7周后进行IPGTT。连续给药7周后大鼠禁食不禁水6h后断头处死并收集躯干血。测定大鼠脏器指数；TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量；测定糖原的含量。3.大鼠分组、造模及给药方法同2。第一周眼眶采血后留取血浆检测相应指标,连续给药7周后大鼠禁食不禁水6h后断头处死并收集躯干血,取大鼠肝脏用于检测葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)活性；测定大鼠血浆中1、7周CORT、 ACTH、CRH、FINS水平；第7周MLT水平。4.大鼠分组、造模及给药方法同2。连续给药7周后大鼠禁食不禁水6h后断头处死,取大鼠海马、肝脏、脂肪与胰腺,迅速放入-80度冻存。检测大鼠肝脏中肿瘤坏死因子-α(TNF-α) mRNA、11β-羟基类固醇脱氢酶-1(11β-HSD1) mRNA、过氧化物酶增殖体活化受体-γ(PPAR-γ) mRNA、糖皮质激素受体(GR)mRNA水平；检测大鼠腹部脂肪组织中TNF-α mRNA、11β-HSD1mRNA、PPAR-γ mRNA.瘦素(Leptin) mRNA.葡萄糖转运体-4(GLUT-4) mRNA以及脂联素(Adipo) mRNA水平；检测大鼠海马中GR mRNA水平；并且用Western Blot法检测大鼠肝脏中GR蛋白表达水平。2型糖尿病患者褪黑素水平与HPA轴的关系研究：5.收集筛选出符合要求的90例T2DM患者及30例健康志愿者的基本资料。患者入院后测量血压与体质指数(Body Mass Index, BMI)。患者禁食12-14小时后,次日晨采集静脉血,分别测定FPG、FINS、C-肽(C-P)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血脂主要包括TC、TG、HDL-C, LDL-C以及CORS、ACTH、CRH、MLT。根据HbA1c水平将患者分为三组(A组：HbA1c＜7.1%,B组：7.1%≤HbA1c≤11.1%和C组：HbA1c＞11.1%)并设年龄和性别相匹配的健康对照组。为评价不同HbA1c水平患者血MLT与HPA轴的关系,对CORS、ACTH、CRH、MLT分别与HbA1c、收缩压、TG、TC、HDL-C、LDL-C、FINS、C-P进行多元线性相关与多元回归分析。分析不同程度的血糖控制水平下内源性MLT与HPA轴激素的关系。结果基于HPA轴调节的褪黑素对慢性应激大鼠糖代谢的影响：1.慢性应激联合高脂饲料喂养,模型组大鼠体重下降明显；第4周时,模型组FPG与正常组对照相比增加了23.38%(7.23±1.20mmol·L-1vs5.86±1.00mmol·L-1, P＜0.05), MLT-M (5.64±0.69mmol·L-1)、MLT-H (5.55±0.83mmol·L-1)剂量组FPG与模型组相比降低了21.99%(P<0.01)、23.24%(P<0.01)；第7周IPGTT试验中,模型组的30min血糖值与正常对照组相比升高了27.09%(18.25±2.60mmol·L-1vs14.36±3.11mmol·L-1, P＜0.01), MLT-H组30min血糖(15.78±3.62mmol·L-1)与模型组相比下降了13.53%；第4周模型组CORT水平较正常组升高11.73%,MLT-M, MLT-H组CORT水平较模型组降低26.01%(P<0.05)与44.84%(P<0.01)；第7周出现HPA轴抑制,模型组CORT水平较正常组降低54.33%(P<0.01),而MLT-M使过度降低的CORT水平升高45.37%(P<0.05)；第7周FINS水平显示,模型组FINS水平、HOMA-IR指数较正常组升高30.09%(P＜0.05),44.48%(P＜0.01), MLT-L, MLT-M组FINS水平较模型组降低26.28%与29.53%(均P<0.01),其HOMA-IR指数较模型组降低36.71%与35.00%(均P<0.01)；此外,造模4周模型组脂代谢也出现紊乱,模型组HDL-C水平较正常组降低21.55%(P＜0.01), MLT-L, MLT-M, MLT-H组HDL-C水平较模型组升高24.18%(P<0.05)、29.67%(P<0.01)与19.78%(P＜0.05), MLT-M改善血脂效果最优。2.造模2周后,模型组大鼠体重较正常组下降9.30%(P<0.05),MLT-H组体重较模型组升高7.18%；第2周时,模型组FPG与正常组相比增加了23.19%(5.63±0.68mmol·L-1vs4.57±0.90mmol·L-1, P＜0.05), MLT-M (4.87±0.80mmol·L-1)、MLT-H (4.77±0.89mmol·L-1)组FPG与模型组相比降低了13.50%、15.28%(均P<0.05)；第2周IPGTT显示,模型组的30min血糖值与正常组相比升高了40.84%(12.69±2.06mmol·L-1vs9.01±1.40mmol·L-1, P＜0.01), MLT-M (10.86±4.30mmol·L-1)、MLT-H (9.70±1.63mmol·L-1)组30min血糖与模型组相比下降了14.42%、23.56%(P<0.05)；第7周IPGTT显示,模型组的30min血糖值与正常对照组相比升高了52.30%(14.24±3.41mmol·L-1vs9.35±2.23mmol·L-1, P＜0.01), MLT-M组30min血糖(9.99±2.68mmol·L-1)与模型组相比下降了29.85%(P<0.05)。此外,MLT对大鼠紊乱的血脂也有调节作用,造模7周后,模型组大鼠TG较正常组升高67.5%(P<0.05),MLT-L、MLT-M、MLT-H组TG较模型组降低了51.74%(P<0.01)、59.20%(P<0.01)与43.28%(P<0.05)；MLT-L、MLT-M、MLT-H组HDL-C水平较模型组相比分别升高了35.48%(P<0.01)、30.11%(P<0.05)与15.05%(P<0.05),因此MLT-L对血脂调节作用最优。大鼠肌糖原含量显示,模型组肌糖原水平较正常组降低27.28%(P＜0.05), MLT-M、MLT-H组肌糖原含量较模型组升高了75.0%(P<0.01)、62.5%(P<0.05)；而MLT可以显著降低肝糖原含量。对脏器指数的观察可见,模型组大鼠。肾上腺指数较正常组升高53.44%(P<0.01),MLT-H使肾上腺指数下降了14.61%；MLT-H组肝脏指数较模型组下降10.85%(P<0.05)。3.造模7周后模型组CORT水平较正常组上升了17.92%, MLT-L、MLT-M、 MLT-H组CORT分别下降了31.78%(P<0.05)、35.23%(P<0.01)以及33.12%(P＜0.05); MLT-L、MLT-M、MLT-H组ACTH和模型组相比降低了8.81%、3.16%以及14.21%(P<0.05)；模型组大鼠FINS水平较正常组降低68.69%(P<0.01),MLT-L、MLT-M、MLT-H组FINS水平和模型组相比分别升高了38.52%、103.28%(P<0.05)以及143.44%(P<0.01)；模型组大鼠G-6-Pase活性较正常组升高34.20%(P<0.05),MLT-M组G-6-Pase活性较模型组下降了24.77%(P<0.05)。4.模型组肝脏、腹部脂肪中TNF-α mRNA表达水平较正常组显著上升(P＜0.01, P＜0.05); MLT-L、MLT-M、MLT-H组肝脏、脂肪中TNF-α mRNA表达水平较模型组显著下降(均P<0.01)。模型组肝脏、脂肪中11β-HSD1mRNA表达水平较正常组显著上升(均P<0.01)；MLT-L、MLT-M、MLT-H组肝脏、脂肪中11β-HSD1mRNA表达水平较模型组显著下降(均P<0.01)。模型组肝脏、脂肪中PPAR-γ mRNA表达水平较正常组显著降低(均P<0.01)；肝脏中,MLT-L、 MLT-M、MLT-H组PPAR-γ mRNA表达水平较模型组上升30.37%、36.03%以及57.12%(均P<0.05)；脂肪中,MLT-M、MLT-H组PPAR-γ mRNA表达水平较模型组上升24.15%(P<0.05)以及43.71%(P<0.01)。此外,对脂肪组织中相关基因考察发现：模型组Leptin mRNA表达水平较正常组上升166.37%(P<0.01),MLT-L、MLT-M、MLT-H组Leptin mRNA表达水平较模型组下降47.42%、22.09%以及50.83%(均P<0.01)；模型组GLUT-4mRNA表达水平较正常组下降30.33%(P＜0.01), MLT-M、MLT-H组GLUT-4mRNA表达水平较模型组升高47.73%以及94.36%(均P<0.01)；与正常组相比,模型组Adipo mRNA表达水平降低18.90%(P<0.05),MLT-L、MLT-M、MLT-H组Adipo mRNA表达水平较模型组升高214.54%、227.95%以及298.48%(均P<0.01)。对海马中相关基因观察发现：模型组GR mRNA表达水平较正常对照组降低50.32%(P<0.01)；MLT-L、MLT-M、 MLT-H组GR mRNA表达水平和模型组相比上升116.22%、104.25%以及81.88%(均P<0.01)；模型组11-βHSD1mRNA与正常组相比仅有下降的趋势,但是MLT-L、MLT-M、MLT-H组11-βHSD1与模型组相比上升了86.70%(P<0.01)、55.41(P<0.01)以及23.16%(P<0.05)。2型糖尿病患者褪黑素水平与HPA轴的关系研究：5.T2DM患者MLT水平与HPA轴的关系研究表明：(1)3组T2DM患者年龄、BMI、病程间差异无统计学意义(均P>0.05)。健康对照组与A组患者HPA轴激素、MLT水平较低；B组与C组患者HPA轴激素、MLT水平普遍较高,激素水平在B组中与健康对照组相比起来,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)用多元线性相关分析方法得出结果,表明在健康对照组与A组患者中,MLT与CRH正相关(r值分别为0.476、0.487,均P<0.05)；B组、C组患者MLT与CORS正相关(r值分别为0.318、0.047,均P<0.05)。(3)多元线性逐步回归分析表明,T2DM患者血清CRH、ACTH、CORS是MLT升高的独立影响因素。结论1.MLT可以改善慢性应激联合高脂饲料喂养的糖耐量减低大鼠的糖脂代谢,改善糖耐量减低,降低FPG,调节HPA轴使其处于稳态,改善IR。2.MLT对慢性应激联合高脂饲料导致的大鼠糖脂代谢紊乱有显著的改善作用：改善大鼠糖耐量减低,降低FPG、TG水平,升高HDL-C水平。20～40mg/kg·d-1剂量对糖代谢改善作用明显,10～20mg/kg·d-1剂量对血脂改善作用较好。此外,MLT可以增加肌糖原含量,降低肝糖原含量。3.MLT可以显著抑制HPA功能亢进。升高异常降低的FINS水平,改善FINS的绝对不足；降低肝糖原分解关键酶G-6-Pase活性,减少葡萄糖入血。4.MLT通过改善肝脏、脂肪组织与海马中相关基因与蛋白的表达,抑制了炎症因子对HPA轴的激活以及无活性的CORT转换成有活性的CORT,改善海马对HPA轴的调控；改善机体对胰岛素敏感性、增加葡萄糖的转运,改善脂代谢。通过这些机制,MLT可以显著的改善糖耐量减低大鼠的糖脂代谢。5.T2DM患者MLT水平与HPA轴激素的关系研究说明不同血糖水平的T2DM患者,MLT与HPA轴的关系及作用机制不同。过高的CORS可刺激MLT分泌,HPA轴与MLT相互影响,协同作用影响糖尿病的发生发展。