深静脉血栓形成(Deep venous thrombosis,DVT)是临床常见血管外科疾病,可导致患肢深静脉瓣膜功能不全、疼痛、反复肿胀、浅静脉迂曲扩张、色素沉着、溃疡及肢体坏死等,严重时可导致致死性的肺栓塞(pulmonary embolism,PE)。目前传统的药物抗凝和溶栓以及手术取栓治疗可引起机体凝血功能下降、消化道出血、手术患者切口并发症发生等并发症,且远期通畅率不理想,因此,如何更加有效的治疗深静脉血栓是血管外科医生当前极为关注的研究方向。骨髓来源的内皮祖细胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor cells BMEPCs)可以分化为血管内皮细胞,并分泌各种促血管生成因子从而促进缺血组织的血管新生。相关研究证实,EPCs可以归巢到深静脉血栓中,进而促进血栓机化再通。但是由于血栓内缺血缺氧的环境抑制EPCs的增殖、迁移和成血管等功能,因此如何更好的提高EPCs在缺氧环境下的功能成为其应用于治疗深静脉血栓的重点。自噬是机体保留下来的高度保守的保护机制,与细胞的生长、繁殖,以及肿瘤的发生过程关系密切;它还是机体对外源性刺激如饥饿、缺氧、感染、药物、生长因子及氧化应激等的适应性反应,减少其对细胞产生的毒性作用。相关研究表明,自噬与细胞功能有紧密的联系,如在缺血组织中,上调细胞自噬水平可抑制细胞的坏死和凋亡。上调自噬可通过激活磷酸化AKT通路,从而对牛动脉内皮细胞的迁移和成血管功能具有明显的促进作用,下调自噬则抑制其功能。长时间的自噬会诱发细胞坏死和凋亡。查阅相关文献,我们发现调控自噬水平对于EPCs的功能影响,特别在深静脉血栓再通中的作用未见相关报道。本研究的主要目的是探讨自噬对内皮祖细胞功能影响及促进静脉血栓再通的作用,为深静脉血栓的治疗提供一种新的治疗思路。分为四个部分,主要研究方法及结果如下。第一部分大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养及鉴定目的:分离、培养并鉴定大鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)。方法:采用密度梯度离心方法分离SD(Sprague-Dawley)大鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs),采用内皮培养体系EGM-2培养基进行定向诱导分化培养14-21天,观察细胞的生长形态变化,采用免疫组化、免疫荧光、流式细胞仪技术检测造血干细胞表面标记CD133及内皮细胞表面标记VEGFR、v WF,采用Matrigel成管实验及Di I-ac-LDL摄取实验检测其成血管及吞噬功能。结果:新分离的大鼠BMMNCs呈圆形,培养24-48h后可见其贴壁,细胞培养至第10~12天逐渐融合,并长满培养瓶底,呈现典型“铺路石或鹅卵石样”外观;Di I-ac-LDL摄取结果显示培养细胞具有内皮细胞吞噬Di I-ac-LDL的特性;Matrigel成管实验可见细胞可形成血管腔样结构;流式细胞仪分析及免疫荧光检测结果显示,细胞高表达VEGFR、v WF等内皮细胞标记物,低表达或几乎不表达CD133造血干细胞标记物。结论:成功地建立了一套大鼠骨髓血管内皮祖细胞分离、培养、诱导分化及鉴定的方法体系。通过内皮培养体系EGM-2的诱导培养,可从SD大鼠BMMNCs中获得EPCs,培养到第14-21天的EPCs呈现晚期EPCs表型特征。第二部分体外缺氧环境下自噬对内皮祖细胞功能的影响目的:探讨自噬对大鼠EPCs增殖、迁移及成血管能力的影响,并探讨其分子机制。方法:分为三组,3-MA组(3-MA(+),3-MA(-));ATG5 si RNA组:将ATG5小干扰RNA(ATG5-si RNA)或阴性对照(NS)转染到EPCs中;ATG5质粒组:将ATG5质粒(ATG5-pc DNA 3.1)或阴性对照(pc DNA)转染到EPCs中。各组EPCs于转染24h后或药物处理20 h后于缺氧培养箱中培养4 h(1%O2,5%CO2和94%N2,37℃),采用Rt-PCR及Western blot检测各组EPCs中ATG5及Beclin-1的表达;采用MTT法检测自噬对EPCs增殖的影响;采用穿膜实验检测自噬对EPCs运动迁移能力的影响;采用matrigel管腔形成实验检测自噬对EPCs成血管能力的影响;采用Western blot检测磷酸化AKT和非磷酸化AKT的表达水平。结果:Rt-PCR及Western blot证实自噬抑制剂3-MA或ATG5-si RNA下调了EPCs中ATG5及Beclin-1的表达,而ATG5-pc DNA 3.1则明显上调了EPCs中ATG5及Beclin-1的表达。MTT法、穿膜实验及matrigel实验说明上调自噬水平可促进缺氧环境下EPCs的增殖、迁移及成血管功能,而下调EPCs自噬水平则抑制其增殖、迁移及成血管功能。上调自噬促进EPCs功能的分子机制为激活磷酸化AKT。结论:上调自噬水平可促进缺氧环境下EPCs的增殖、迁移及成血管功能。第三部分ATG5慢病毒表达载体的构建及其在内皮祖细胞中的稳定表达目的:构建ATG5慢病毒表达载体p Ubi-MCS-EGFP-ATG5,然后感染EPCs,建立稳定表达ATG5的EPCs细胞,利用实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)验证感染后ATG5在EPCs的显著提高,为研究体内条件下自噬对EPCs在深静脉血栓再通中的作用奠定基础。方法:将聚合酶链反应(PCR)扩增得到的ATG5前体序列pre-ATG5和慢病毒载体p Ubi-MCS-EGFP经酶切后连接产生p Ubi-MCS-EGFP-ATG5,再与辅助包装载体一起在293T细胞中包装病毒,收集病毒颗粒后感染EPCs。用q PCR方法检测感染后的EPCs中ATG5的表达。结果:慢病毒表达载体p Ubi-MCS-EGFP-ATG5构建成功,病毒颗粒感染EPCs后能有效提高EPCs中ATG5的表达。结论:成功构建了pUbi-MCS-EGFP-ATG5慢病毒表达载体及稳定表达ATG5的EPCs细胞系。第四部分自噬对内皮祖细胞在深静脉血栓再通中的作用目的:探讨自噬对大鼠EPCs在深静脉血栓机化再通中的作用。方法:使用慢病毒载体p Ubi-MSC-EGFP/p Ubi-MCS-EGFP-ATG5转染EPCs,通过下腔静脉结扎法构建大鼠深静脉血栓模型,再将转染后的EPCs移植到大鼠血栓模型中,分别在术后7天、14天处死模型,取出血栓标本。通过标本称重观察血栓溶解情况;通过冰冻切片荧光示踪观察EPCs归巢情况;通过HE染色观察自噬对EPCs在深静脉血栓机化中的作用;通过CD34免疫组化观察自噬对EPCs在深静脉血栓再通中的作用。结果:各组GFP阳性细胞数目比较:EPCs/ATG5组>EPCs/vector组>对照组,说明移植的EPCs可定向归巢至深静脉血栓中,上调EPCs中ATG5水平可显著促进其归巢能力;各组血栓重量比较:对照组>EPCs/vector组>EPCs/ATG5组,可见EPCs移植后可促进静脉血栓溶解,上调EPCs中ATG5水平可显著促进其溶栓能力;HE染色和CD34免疫组化提示EPCs移植后可促进血栓的机化再通,上调EPCs中ATG5水平可显著提高其促静脉血栓机化再通能力。结论:移植的EPCs可定向归巢到静脉血栓中,并促进血栓的溶解、机化和再通。上调ATG5水平激活自噬增强了EPCs的归巢能力,并促进了其在血栓机化再通中的作用。激活EPCs自噬可能为DVT的治疗带来希望。