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目的：建立一种同位素稀释高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法测定血清1α,25-二羟维生素D2 (lα,25(OH)2D2)和1α,25-二羟维生素D3 (lα,25(OH)2D3);对基于不同方法学的1α,25-二羟维生素D(lα,25(OH)2D)检测系统进行方法学评价及比较；应用本研究建立的LC-MS/MS方法测定表观健康人群血清lα,25(OH)2D水平,尝试建立生物参考区间。方法：采集分离血清样本,以同位素标记的lα,25(OH)2D3作为内标,正己烷-乙酸乙酯溶液作为提取剂,高速涡旋提取。离心后吸取上清,37℃真空离心干燥。残渣用甲醇-水溶液重构后应用LC-MS/MS分析技术进行分析检测。采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式,以标准品制作标准曲线结合稳定同位素内标法定量,建立LC-MS/MS法测定lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3的方法。对添加不同水平lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3标准品的混合人血清连续五天进行重复检测,每次检测每个水平样本进行3次重复测定,以考察方法的精密度。同时评价血清样本添加不同浓度标准品的加样回收率。收集2015年4月至6月期间北京协和医院173例患者血清,同时应用本研究建立的LC-MS/MS方法和Diasorin化学发光免疫测定法(CLIA)检测血清lα,25(OH)2D3浓度水平并对Diasorin试剂盒检测线性、精密度等性能进行评估。应用Excel 2007对检测精密度等数据及血清样本检测结果进行统计分析,比较两种方法的检测性能及临床样本检测结果。收集2015年7月至2015年9月期间北京协和医院体检中心200例表观健康人血清,其中男性与女性各100人,年龄18～87岁。200例表观健康人群中,有175例年龄小于65岁,从175例血清样本中随机抽取20例血清用于参考区间验证,剩余155例血清用于参考区间建立。用本研究建立的LC-MS/MS法测定血清lα,25(OH)2D3和lα,25(OH)2D2浓度。以非参数方法估计样本的参考区间,取2.5%-97.5%百分位数的值作为参考范围,并采用小样本验证的方法对参考区间进行验证。结果：用LC-MS/MS法在本实验条件下可同时检测血清lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3,化合物保留时间约为4.7 min,分析时间为10 mmin,特异性高,未见明显干扰因素。化合物与内标峰面积比与对应的浓度线性相关系数均大于0.990。lα,25(OH)2D2批内和总变异分别为：3.88%～6.35%和5.43%-9.41%,lα,25(OH)2D3批内和总变异分别为2.34%-6.79%和5.37%-8.40%。lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3的加样回收率范围分别为：95.80%-104.21%和95.91%-99.83%。lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3的检测限(LOD)均为5pg/mL,定量限(LOQ)均为10 pg/mL,具有较高的灵敏度。Diasorin CLIA法测定血清la,25(OH)2D3浓度的批内变异分别为2.7%、5.0%和5.0%,总变异分别为13.8%、15.0%和13.5%。取高值(167.8 pg/mL)和低值(36.4pg/mL)两种血清按不同比例混合稀释,并用Diasorin试剂盒重复测量检测,评价Diasorin CLIA法检测试剂盒的检测线性,得到的线性方程为：y=0.916x+3.626(R2=0.991)。173例血清样本两种方法检测结果的相关分析方程为：y=0.9614x+4.3977,R2=0.8041。将两种方法测定173例患者血清样本结果作Bland-Altman图,差值范围为-23.1 pg/mL～26.1 pg/mL,5.78%(10/173)的样本检测结果落在95%一致性界限以外。LC-MS/MS法获得人群的95%参考区间为32.9 pg/mL～112.5 pg/mL。结论： 本研究成功建立了同时测定血清lα,25(OH)2D2和lα,25(OH)2D3的LC-MS/MS方法,该方法无需对待测物进行衍生化处理,操作简便、灵敏度好、特异性高,可应用于评价血清1α,25-二羟维生素D的含量。应用此方法评价的CLIA方法性能较好,可用于临床。应用本研究建立的LC-MS/MS方法初步建立的参考区间。