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研究目的:分析肥大细胞(mast cell,MC)来源的外泌体的生物学特性,检测其结合游离IgE从而抑制肥大细胞活化的可能性,利用过敏性哮喘小鼠模型探讨骨髓来源肥大细胞释放的外泌体对过敏反应的抑制效果及其机制。研究方法:(1)诱导小鼠骨髓细胞分化为肥大细胞,差速离心法提取培养液中的外泌体,采用电镜、免疫印迹、流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测外泌体的形态学、分子表达及其与来源细胞的相互作用;(2)将骨髓来源肥大细胞(bone marrow mast cell,BMMC)和IgE受体阴性的小鼠肥大细胞系P815(对照细胞)来源的外泌体分别与IgE孵育后,用β己糖苷酶和组胺释放实验检测外泌体与IgE共同孵育后对肥大细胞脱颗粒的影响,并采用免疫印迹法分析肥大细胞活化信号通路相关蛋白的表达;(3)以卵清蛋白(OVA)注射致敏和雾化吸入激发BALB/c小鼠建立哮喘模型,尾静脉注射BMMC来源的外泌体予干预治疗,分别检测干预1、2、3个月后小鼠气道高反应(AHR),血清OVA特异性IgE(OVA-sIgE)含量,肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中炎症细胞数量和种类、组胺水平和细胞因子的变化,观察外泌体应用对肺组织炎症的治疗效果和气道重建的影响。研究结果:(1)小鼠骨髓细胞在SCF和IL-3的诱导下经4周培养即可分化为肥大细胞并产生外泌体。肥大细胞外泌体呈50-80nm的圆形囊泡结构,表达FcεRI蛋白。负载荧光染料PKH67后,荧光显微镜下观察发现外泌体可以被来源细胞摄取,PKH67阳性细胞数在孵育1h后迅速上升,12h到达峰值;(2)IgE与BMMC来源的外泌体共同孵育后,与肥大细胞结合的IgE较对照组明显减少,减少程度与加入外泌体的量呈正相关,且外泌体能与肥大细胞竞争性结合IgE,而无IgE受体表达的P815细胞来源的外泌体则无此效应,表明BMMC来源的外泌体荷载的FcεRI蛋白与游离IgE结合。IgE与BMMC来源的外泌体共同孵育后致敏肥大细胞,DNP-HSA激活,肥大细胞β己糖苷酶和组胺释放率明显降低,Western blot显示肥大细胞活化的PLCγ1-PKC通路中磷酸化的PLCγ1、PKC蛋白表达水平与对照相比明显降低。(3)体内研究结果表明,BMMC来源的外泌体能有效改善哮喘小鼠的AHR,减少哮喘小鼠血清OVA特异性IgE(OVA-specific IgE,OVA-sIgE)水平,BALF中炎症细胞数量以及组胺和Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)水平,增加抗炎因子(IL-10和IFN-γ)的分泌,减轻肺组织炎症细胞的浸润、黏液分泌及气道平滑肌的增生。外泌体抑制过敏反应的效应随治疗时间的延长而增强。研究结论:BMMC外泌体荷载有FcεRI蛋白并能与细胞外游离IgE结合,使IgE与肥大细胞的结合减少,抑制肥大细胞的活化从而降低过敏反应的发生。体内研究表明BMMC释放的外泌体能有效减轻小鼠过敏性哮喘的特征。本研究表明BMMC释放的外泌体有望成为一种新型的抗IgE治疗药物。