肾痿复方通过TLR4/NF-κB信号通路影响巨噬细胞极化改善UUO大鼠肾纤维化

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目的:单侧输尿管结扎建立肾脏炎症、纤维化模型,观察肾痿复方治疗后UUO(Unilateral ureteral obstruction)大鼠肾组织病理损伤及肾纤维化的改变,本课题旨在研究肾痿复方对M1/M2巨噬细胞极化及炎症因子表达的作用及机制,为复方中药防治慢性肾脏病提供科学依据。  方法:25只雄性SD大鼠适应性喂养一周后,随机分为5组,分别为假手术组(sham)、UUO模型组(UUO)、UUO模型+肾痿复方治疗低剂量组(UUO+Low)、UUO模型+肾痿复方治疗高剂量组(UUO+High)、UUO模型+厄贝沙坦(UUO+Irbesartan)阳性对照组,本实验每组各5只大鼠,造模前分别予以生理盐水、低、高剂量肾痿复方、厄贝沙坦灌胃预处理3天,造模完成后各组继续灌胃治疗7天,治疗结束后取梗阻侧肾脏组织利用HE染色观察肾脏形态学改变;通过天狼星红染色肾脏间质胶原纤维、免疫组化染色检测肾脏组织ColⅢ表达及Western Blot检测肾脏组织α-SMA表达,观察肾脏纤维化改变;利用流式细胞术及RT-PCR检测M1型巨噬细胞标记iNOS、M2型巨噬细胞标记MRC1表达水平了解巨噬细胞极化;通过免疫组化染色、RT-PCR检测肾脏组织中炎症介质TNF-α、IL-1β表达;通过Western Blot法检测TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达情况。  结果:1、肾脏病理及肾纤维化改变:与假手术大鼠相比,UUO大鼠肾脏组织HE染色显示肾小管明显扩张,间质炎细胞浸润,天狼星红染色显示肾脏组织间质大量红色胶原纤维沉积(P<0.01),免疫组化染色显示肾脏组织间质ColⅢ表达明显增加(P<0.01),Western Blot法示肾脏组织α-SMA表达明显增加(P<0.01)。而肾痿复方、厄贝沙坦治疗后大鼠肾小管扩张及间质炎细胞浸润程度均明显减轻;肾间质红色胶原纤维面积显著减少(P<0.01),肾间质ColⅢ表达明显降低(P<0.01),肾脏组织α-SMA表达明显下降(P<0.01),且高剂量组效果更明显,差异有统计学意义;2.巨噬细胞极化情况:与假手术比较,UUO大鼠M1型巨噬细胞(F4/80+iNOS+)百分比明显增加(P<0.01),M2型巨噬细胞百分比(F4/80+CD206+)下降(P<0.01),巨噬细胞极化为M1型;肾痿复方、厄贝沙坦治疗后M1型巨噬细胞百分比及标志基因iNOS表达明显下降(P<0.01),M2型巨噬细胞百分比及标志基因MRC1表达明显增加(P<0.01);且高剂量治疗改变更明显(P<0.01)。3.炎症介质表达:与假手术大鼠比较,UUO大鼠肾组织炎症介质TNF-α、IL-1β表达平均光密度值明显增加(P<0.001),肾痿复方、厄贝沙坦治疗后炎症介质表达明显降低(P<0.001),RT-PCR检测炎症介质基因表达结果与免疫组化分析结果一致;4.TLR4/NF-κB通路改变:与假手术比较,UUO大鼠肾组织中TLR4/NF-κB通路相关蛋白TLR4、IκBα、P-IκBα、P65、P-P65表达水平明显上升(P<0.005),而肾痿复方、厄贝沙坦治疗大鼠,TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达水平明显下降(P<0.005)。  结论:1.中药肾痿复方可减轻UUO大鼠肾组织病理损伤,减少间质胶原纤维沉积,减轻肾纤维化,保护肾脏,其作用存在剂量效应。2.中药肾痿复方可下调M1型巨噬细胞表达,上调M2型巨噬细胞表达,促进促炎M1型巨噬细胞极化为抗炎M2型,减少炎症介质表达;3.中药肾痿复方能下调TLR4/NF-κB通路表达,可能通过下调TLR4/NF-κB通路调节巨噬细胞极化,减轻肾纤维化,延缓慢性肾脏病进展。
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