布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病,严重危害公共卫生安全和畜牧业发展。布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,其侵入宿主细胞后会面临恶劣的生存环境。为了应对胞内复杂的环境,布鲁氏菌需要调控相关基因的表达以保证其生存和复制。随着sRNA在细菌中不断被发现,sRNA的功能也逐渐被人们熟知,其在细菌基因表达的调节中发挥重要作用,可以影响生物膜形成、代谢、群体感应、应激反应及毒力等。Hfq是一种RNA伴侣蛋白,可以介导sRNA的基因调控。布鲁氏菌中也存在sRNA,但对其参与的转录调控尚不明确。为了研究布鲁氏菌中sRNA的相关功能,本研究应用二代测序技术和sRNA-Detect算法对牛种布鲁氏菌2308株的sRNA进行预测,选取部分验证正确的sRNA进行功能研究,包括其对细菌毒力的影响以及应激条件下的转录,并寻找这些sRNA的作用靶点。1、提取该菌株的总RNA,进行RNA-Seq高通量测序,基于测序结果采用sRNA-Detect算法进行sRNA预测,并采用反转录PCR对sRNA进行验证。结果共预测出3523条候选的sRNA,随机挑选14个sRNA均得到验证。另外经验证,在2308 hfq缺失株中,其中13个sRNA的转录水平都下降了2倍以上,表明Hfq蛋白与维持这些sRNA的稳定性密切相关。2、挑选染色体1上8个转录水平较高、位于CDS外且不在相邻基因启动子区域的sRNA进行缺失。利用融合PCR扩增挑选的8个sRNA上下游同源臂并融合,克隆到pBlue载体,然后将卡那霉素抗性基因插入上下游同源臂之间用作筛选缺失株的标记。将pBlue-sRNA同源臂-Km质粒电转2308株,涂Km抗性的TSA平板培养,然后挑取单菌落鉴定。将鉴定正确的缺失株以100MOI感染鼠源巨噬细胞RAW264.7,分别在1h和48h统计胞内存活的细菌数目。结果表明sRNA0304缺失株与亲本株相比在鼠源巨噬细胞48h时内增殖能力明显下降。3、将2308株接种到TSB震荡培养48h后,依次取1mL离心弃上清,分别用1mL含500mM NaCl、pH 4.5、含2.5mM H₂O₂的TSB重悬,置于37℃1h后,提取细菌总RNA。应用荧光定量技术测定sRNA在应激条件下的转录变化。结果表明,sRNA0009、sRNA0283、sRNA0304和sRNA0344在高渗、酸性和强氧化性的条件下,转录水平均发生了显著上调,甚至达到4倍以上,sRNA0365在酸性环境下也上升了2倍以上,表明这5种sRNA均与细菌应激反应有关。4、使用TargetRNA2预测上述8个sRNA的靶标并应用双质粒报告系统验证。将sRNA及其启动子PCR扩增后连接到载体pUT18C,将预测的靶标及其启动子PCR扩增后连接到构建的pMR-LacZ质粒,然后将两种质粒依次转入到BTH101,并在含X-gal平板上培养,根据平板上颜色变化判断sRNA对其靶标的调控。结果表明sRNA0009、sRNA0283和sRNA0304的作用靶点分别为BAB1₂057、BAB1₁813和BAB1₁023,且均为负调控。本研究利用RNA-seq技术筛选出新的sRNA,并对其参与的环境应激反应、毒力和作用靶点进行研究,为研究布鲁氏菌病的致病机制和治疗提供参考。