ST段抬高性心肌梗死(STEMI)是世界范围内人类主要的致死原因之一，目前最佳干预手段是通过冠状动脉介入治疗(PCI)对缺血心肌进行早期再灌注。然而，即使给予及时的再灌注治疗，临床上发现部分STEMI患者在PCI后仍然出现心功能降低甚至心源性休克，其重要原因之一则为心肌缺血再灌注损伤(MIRI)，即缺血心肌恢复血流的本身可能导致心肌细胞的损伤及死亡。MIRI产生的主要环节，包括氧化应激、钙超载、生理性pH快速恢复、炎症（中性粒细胞浸润）以及线粒体功能障碍等。研究发现PI3K/AKT/GSK3β是重要的抗凋亡信号通路之一，可促进细胞的存活与增殖。我们课题组前期临床研究证实速效救心丸对冠心病PCI围手术期患者具有一定的心肌保护作用，然而其具体作用机制是否与通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路抑制心肌细胞的凋亡有关，目前国内外未见相关报道。本研究旨在通过建立HL-1心肌细胞缺氧复氧损伤模型，在细胞水平模拟心肌缺血再灌注损伤，应用PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT/GSK3β信号通路，研究速效救心丸预处理后PI3K/AKT/GSK3β信号通路中磷酸化/总PI3K、AKT、GSK3β表达的变化和对线粒体凋亡的影响，探讨速效救心丸减轻心肌缺血再灌注损伤的机制。　　第一部分:速效救心丸预处理HL-1心肌细胞缺氧复氧损伤模型的建立及对心肌细胞凋亡的影响　　目的:通过建立HL-1心肌细胞缺氧复氧损伤模型，在细胞水平模拟心肌缺血再灌注损伤，确定速效救心丸的药物浓度;观察速效救心丸对HL-1心肌细胞生存率、凋亡的影响;通过加入PI3K的抑制剂LY294002初步探讨速效救心丸是否通过PI3K/AKT/GSK3β信号转导通路减少心肌细胞的凋亡。　　方法:取状态较好的HL-1心肌细胞，铺24孔板，细胞密度控制在40％左右，加不同浓度的速效救心丸(10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)30min后，模拟缺氧复氧条件，诱导细胞凋亡，观察速效救心丸减轻心肌细胞缺氧复氧损伤的作用，并确定后续实验过程中速效救心丸的药物浓度。在培养48h后随机分为4组:正常对照组（KB组）;缺氧复氧损伤组(Model组):细胞行缺氧4h复氧6h;速效救心丸预处理+Model组(SX组):细胞缺氧前加入100ug/ml速效救心丸30min后，再行缺氧复氧;LY294002+SX+Model组(LY294002组):培养基中加入浓度为10μM的LY294002，30min后加速效救心丸，30min后再行缺氧复氧。CKK8法测细胞损伤/细胞增殖的变化;流式细胞仪检测AnnexinⅤ/PI双染法心肌细胞凋亡率。　　结果:当速效救心丸浓度为100ug/ml时，对心肌细胞损伤保护效果最佳。　　各处理组细胞活力的影响:与空白组(0.38±0.01)相比，模型组(0.24±0.01)心肌细胞严重受损，细胞存活率明显降低，两者有显著性差异(P＜0.05);速效救心丸组(0.32±0.01)与模型组相比细胞损伤/细胞增殖率升高，两者有显著的统计学差异(P＜0.05);PI3K抑制剂LY294002组(0.28±0.00)与速效救心丸组相比细胞损伤/细胞增殖率有所降低，两者之间的差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组相比，两者有统计学差异(P＜0.05)。　　流式细胞仪测心肌细胞凋亡:空白组(3.15±0.24)相比，模型组(14.44±1.03)的细胞凋亡率明显增加(P＜0.05);与模型组相比，速效预保护(7.04±0.34)可显著抑制心肌细胞的凋亡(P＜0.05);与速效组相比，PI3K抑制剂(11.88±0.57)可减弱速效对心肌细胞的保护作用(P＜0.05)。　　结论:通过速效保护预实验可以初步得出，当速效救心丸浓度为100ug/ml时，对心肌细胞损伤保护效果最佳，故后续实验加速效保护浓度初定为100ug/ml。速效救心丸预处理后有一定的抑制心肌细胞凋亡的作用，而加入PI3K的抑制剂后，速效救心丸对缺氧复氧损伤的心肌保护作用被减弱，提示速效救心丸可能是通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路发挥心肌保护作用的。　　第二部分:速效救心丸通过PI3K/AKT/GSK3β信号转导通路发挥对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用机制　　目的:研究速效救心丸预处理后PI3K/AKT/GSK3β蛋白和转录水平表达的变化，进一步证明速效救心丸保护心肌的作用与PI3K/AKT/GSK3β信号转导通路有关。　　方法:取状态较好的HL-1心肌细胞，铺24孔板，细胞密度控制在40％左右，在培养48h后随机分为4组:正常对照组（KB组）;缺氧复氧损伤组(Model组):细胞行缺氧4h复氧6h;速效救心丸预处理+Model组(SX组):细胞缺氧前加入100ug/ml速效救心丸30min后，再行缺氧复氧;LY294002+SX+Mode1组(LY294002组):培养基中加入浓度为10μM的LY294002，30min后加速效救心丸，30min后再行缺氧复氧。应用Western blot检测p-PI3K、T-PI3K、p-AKT、T-AKT、p-GSK3β、T-GSK3β，RT-PCR检测PI3K、AKT、GSK3β的转录水平。　　结果:心肌细胞PI3K蛋白表达水平:与空白组(0.43±0.01)相比，模型组(0.15±0.01) p-PI3K/tPI3K蛋白表达明显降低，两者有显著性差异(P＜0.05)，说明缺氧复氧损伤后，PI3K磷酸化水平降低;速效救心丸组(0.35±0.03)与模型组相比p-PI3K/tPI3K蛋白表达水平升高，两者有显著的统计学差异(P＜0.05)。　　心肌细胞AKT蛋白表达水平:与空白组(0.53±0.02)相比，模型组(0.18±0.01) p-AKT/tAKT蛋白表达明显降低，两者有显著性差异(P＜0.05)，说明缺氧复氧损伤后，AKT磷酸化水平显著降低;速效救心丸组(0.42±0.01)与模型组相比p-AKT/tAKT蛋白表达明显升高，两者差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。LY294002组(0.29±0.04)可降低速效组的磷酸化水平，差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。　　心肌细胞GSK3β蛋白表达水平:与空白组(0.62±0.01)相比，模型组(0.26±0.01) p-GSK3/tGSK3β蛋白表达明显降低，两者有显著性差异(P＜0.05)，说明缺氧复氧损伤后，AKT磷酸化水平显著降低;速效救心丸组(0.53±0.01)与模型组相比p-GSK3/tGSK3β蛋白表达水平升高，两者有显著的统计学差异(P＜0.05)。LY294002组(0.37±0.02)可降低速效组的磷酸化水平，差异具有显著的统计学意义(P＜0.05)。　　对PI3K、AKT、GSK3β相对表达量的影响PI3KCA:与空白组(0.96±0.03)相比，模型组(2.03±0.02)PI3K的转录水平增高，两者有显著性差异(P＜0.05);速效救心丸组(1.25±0.05)与模型组相比PI3K的转录水平降低，两者有显著的统计学差异(P＜0.05)。AKT:与空白组(0.93±0.04)相比，模型组(0.69±0.04) AKT的转录水平降低，两者有显著性差异(P＜0.05);速效救心丸组(0.78±0.04)与模型组相比AKT的转录水平无显著差异，不存在统计学意义。GSK3β:空白组(0.93±0.04)、模型组(0.69±0.04)、速效救心丸组(0.78±0.04)GSK3β的转录水平无显著差异，不存在统计学意义。　　结论:速效救心丸可通过激活PI3K/AKT/GSK3β途径，增强PI3K/AKT的活化，提高GSK3β的磷酸化水平，进而发挥减轻心肌细胞的缺氧复氧损伤的作用。　　第三部分:速效救心丸通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路抑制线粒体凋亡　　目的:探讨速效救心丸是否能够抑制线粒体通透性转换孔开放;并在此基础上进一步研究速效救心丸是否通过PI3K/AKT/GSK3β通路抑制线粒体凋亡途径，从而保护心肌。　　方法:取状态较好的HL-1心肌细胞，铺24孔板，细胞密度控制在40％左右，在培养48h后随机分为4组:正常对照组（KB组）;缺氧复氧损伤组(Model组):细胞行缺氧4h复氧6h;速效救心丸预处理+Model组(SX组):细胞缺氧前加入100ug/ml速效救心丸30min后，再行缺氧复氧;LY294002+SX+Model组(LY294002组):培养基中加入浓度为10μM的LY294002，30min后加速效救心丸，30min后再行缺氧复氧。JC-1试剂盒测线粒体膜电位。　　结果:心肌细胞出现损伤后，可使线粒体膜电位下降（红色荧光亮度减弱）(P＜0.05)，对HL-1细胞进行药物预保护后，相对于模型的细胞，线粒体膜电位上升（红色荧光亮度增强）(P＜0.05)，速效救心丸对心肌损伤具有良好的保护作用。加入PI3K抑制剂后可抑制速效救心丸的保护作用(P＜0.05)。　　结论:速效救心丸通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路抑制线粒体凋亡。