论文部分内容阅读
目前,抗肿瘤聚合物纳米药物的抑瘤效果仍不尽如人意。这是因为从静脉给药到药物被输送到肿瘤胞浆的过程中,载药聚合物胶束必须经历包含血液循环（circulation）、肿瘤组织积累（accumulation）、肿瘤内部扩散渗透（penetration）、肿瘤细胞内吞（internalization）和胞内药物释放（drug release）在内的五个步骤,称为CAPIR级联递送。正是CAPIR级联递送的复杂性使得药物总体递送效率偏低,并导致最终较差的治疗效果。这种复杂性体现在CAPIR级联中各步骤对胶束物理化学性质的要求彼此矛盾。最为典型的是在血液循环的过程中,要求聚合物胶束在生理p H条件下能维持胶体稳定以充分保护药物,避免药物在血液中提前释放;但在肿瘤细胞的p H条件下则要求药物于短时间内从胶束中快速并大量地被释放到细胞质。应运于此要求,p H敏感聚合物胶束可以克服这种CAPIR级联对酸度的矛盾性要求。p H敏感聚合物胶束可以在生理p H下尽可能避免药物提前释放;当胶束被输送到肿瘤细胞外基质（ECM）并被细胞摄取后,它们的酸性环境（p H约4.0-7.0）会触发p H敏感胶束快速释放药物。目前,虽然可以在细胞外模拟这种根据肿瘤微环境酸度梯度变化所要求的药物释放行为,但这种模拟并不能反应胶束在肿瘤细胞内动态释放药物的真实命运。尤其用肉眼直接观察这种细胞内酸度变化所触发的药物动态释放则更为困难。除此之外,精准操控此类聚合物胶束在不同p H条件下的药物释放行为仍是一个挑战,尤其是在较高载药量的情况下仍很难抑制药物的提前释放。由此鉴之,可视化研究p H敏感聚合物胶束在细胞内的命运以及实现胶束对药物释放行为的精准操控仍是抗肿瘤聚合物纳米药临床转化的难点。在本研究中,为了获得同时具备细胞内动态药物释放过程可视化监测和释放行为可操控的p H敏感抗肿瘤聚合物胶束,我们制备了四苯乙烯（TPE）/阿霉素（DOX）功能化的p H敏感型共组装纳米前药。本工作是基于一种新型的两亲性糖肽类似物HA-PFLG,其中亲水段HA是癌细胞表面过表达受体靶向的透明质酸,疏水段N3-PFLG为聚氨基酸,后者侧链含有呋喃环;后续我们将抗癌药物阿霉素（DOX）通过p H敏感的酰腙键联接到N3-PFLG侧链,得到一种p H敏感的糖肽类似物HA-PFLG-DOX;与此同时,将具有聚集诱导发光效应（AIE）的四苯乙烯（TPE）也偶联到HA-PFLG的多肽侧链,得到另一种AIE型糖肽类似物HA-PFLG-TPE。DOX和TPE均通过Diels-Alder（D-A）偶联反应接枝到N3-PFLG侧链,该方法的优点是不需要任何添加剂,节省了纯化的步骤,提高了后续纳米颗粒的制备效率。我们将两种大分子HA-PFLG-TPE和HA-PFLG-DOX分别按照0:1,1:1和2:1的质量比共溶于二甲基亚砜（DMSO）,在水溶液中透析即可得HA-PFLG-DOX胶束、HA-PFLG-TPE/HA-PFLG-DOX共组装胶束。当HA-PFLG-TPE和HA-PFLG-DOX的质量比分别为0:1,1:1和2:1时,胶束的载药量/包封率分别为24.9%/86.4%、11.2%/90.0%、7.6%/96.7%;动态光散射（DLS）测得HA-PFLG、HA-PFLG-TPE、HA-PFLG-DOX以及HA-PFLG-DOX/HA-PFLG-TPE（1/2）四种胶束的平均粒径分别为119.1、142.6、194.6和202.2 nm;表面平均电位分别为-19.9,-19.1,-18.9和-19.7 m V;透射电子显微镜（TEM）显示它们分别为尺寸不一的球型颗粒、尺寸不一的橄榄型颗粒、均一的球型颗粒以及不规则的球形颗粒;此外,用DLS及DOX体外药物释放动力学研究了胶束的p H敏感性以及TPE含量对DOX释放行为的影响,结果表明在酸性较高的条件下,DOX释放得更多、更快;在同等酸度条件下随着TPE含量的增多,DOX释放得更少、更慢。这表明胶束不仅在肿瘤微环境中具有刺激性响应,而且还可以通过改变TPE的含量来控制药物的释放速率及累积释放量;有趣的是,利用TPE分子的AIE特性以及DOX和TPE之间的荧光共振能量转移（FRET）效应,可以实现对HA-PFLG-DOX/HA-PFLG-TPE（1/2）胶束中DOX在细胞内/外动态递送过程的可视化监测;MTT细胞毒性实验表明,胶束能有效地抑制Hela细胞的增殖;利用流式细胞仪（FCM）对胶束的内吞途径进行了研究,结果表明胶束的内吞途径和载体类型有关;HA-PFLG-DOX依赖于网格蛋白介导的内吞方式,而HA-PFLG-DOX/HA-PFLG-TPE（1/2）共组装胶束同时依赖于网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径;激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）结果表明胶束被肿瘤细胞内吞后,可以成功地将DOX递送入细胞核。总之,在该项工作中我们提供了一种简易制备具有细胞内药物释放可视化、释放控制、高效负载、突释抑制和主动靶向等能力的多功能抗肿瘤纳米药物治疗平台的新方法,这为未来多功能纳米递送系统的开发提供了一种新思路。