论文部分内容阅读
目的本课题组前期研究发现,新型可溶性环氧化物水解酶抑制剂(soluble epoxide hydrolase inhibitor, sEHi) t-AUCB (trans-4-[4-(3-adamantan-1-yl-ureido)-cyclohexyloxy]-benzoic acid)具有抗缺血性心律失常作用。且t-AUCB可调节缺血心肌中微小RNA-1(microRNA-1, miR-1)的表达,进一步调控其靶基因KCNJ2、GJA1及其所编码的蛋白Kir2.1、Cx43的表达而改变心肌细胞的电生理特性从而达到抗心律失常的发生。研究表明miR-1的表达受血清应答因子(serum response factor, SRF)、肌细胞增强因子-2(myocyte enhancer factor, MEF-2)等心肌必需转录因子和信号通路调控,并且转录因子和信号通路之间可能存在相互作用。本研究旨在探讨t-AUCB通过转录因子SRF对miR-1的调控作用,为临床上抗缺血性心律失常的防治提供新思路。方法给予8周雄性昆明小鼠饮用水中加入终浓度为0.2、1、5mg/L的sEHi制剂t-AUCB7天,仅喂以饮用水7天作为空白对照组,建立心肌梗死模型或进行假手术。24小时后处死小鼠并取出心脏。对心脏进行HE染色观察心梗形成情况。并对缺血区心肌组织用Real-timePCR检测SRF mRNA的表达情况,用Western-blot检测SRF蛋白的表达。给予8周雄性昆明小鼠喂以5mg/L t-AUCB7天或喂以饮用水7天,建立心梗模型或进行假手术后以miR-1过表达转染试剂micrONTM mmu-miR-la-3p agomir或阴性对照物micrONTM mmu-miR-la-3p agomir negative control进行尾静脉注射。并对缺血区心肌组织用Real-time PCR方法检测miR-1, SRF mRNA表达情况,Western-blot检测SRF蛋白的表达情况。用三组不同序列siSRF转染心房肌细胞株(HL-1细胞)使SRF沉默,提取细胞蛋白,用Western-blot法检测SRF蛋白的表达,筛选出最佳沉默效果siSRF序列,并进行下一步验证研究。结果1、心肌梗死24小时后小鼠缺血心肌中的SRFmRNA表达增高,而SRF蛋白表达降低,差异均具有统计学意义(all P<0.05)；2、sEHi制剂t-AUCB在一定浓度范围内能够浓度依赖性地使SRF mRNA表达降低,而SRF蛋白表达增高,0.2mg/L、1mg/L、5mg/L t-AUCB干预±心梗组与饮用水±心梗组相比均具有统计学差异(allP<0.05)；3、尾静脉注射miR-1过表达试剂：mmu-miR-1a-3p-agomir,能够使缺血心肌中miR-1水平进一步上调,t-AUCB能够拮抗mmu-miR-1a-3p-agomir的上述作用(all P<0.05);4、尾静脉注射miR-1过表达试剂mmu-miR-1a-3p-agomir,能够使缺血心肌中SRF mRNA水平进一步升高,而SRF蛋白水平进一步降低(all P<0.05)；5、t-AUCB干预,并且尾静脉注射miR-1过表达试剂mmu-miR-1a-3p-agomir,小鼠心梗24小时后缺血区心肌SRF mRNA表达较未用t-AUCB干预组下降,但差异不具有统计学意义(P>0.05),但SRF蛋白水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05)；6、在心房肌细胞株(HL-1细胞)中,siSRF1序列沉默SRF蛋白效果最好。结论sEHi制剂t-AUCB可能部分通过调节转录因子SRF的水平,进而影响miR-1的表达来达到抗缺血性心律失常的作用。SRF与miR-1之间存在着复杂的反馈调节机制,并可能有其它基因以及microRNA共同参与。