论文部分内容阅读
遗传物质的稳定性是生命活动存在和延续的基础。作为遗传信息的载体,DNA分子在受到外界因素如紫外线、红外线或者药物分子等刺激后,会发生结构上的变化。不仅如此,在正常的细胞代谢过程中如DNA复制和重组,DNA也会产生错误的中间体。这些DNA分子结构的变化往往导致基因突变,若得不到及时修复,它们会造成严重的后果—细胞的死亡和癌变。为了避免这种情况,生物体进化出多种来修复各种各样DNA损伤的机制如核苷酸切除修复,同源重组修复等。在细胞分裂期中,DNA链问交联(Interstrand crosslinks, ICLs)是一种严重的损伤,它会阻碍复制叉的前进,使DNA复制受阻,细胞进而也无法完成细胞周期。人源细胞中存在一条专门应对这类突变的信号通路,被称为范可尼贫血信号通路(Fanconi anemia pathway)。该通路由一系列蛋白介导,这些蛋白的突变会导致范可尼贫血症(Fanconi anemia, FA)的发生。到目前为止,人们已发现有15种蛋白(FA蛋白)的突变会产生FA。除了FA蛋白外,还存在多种FA辅助因子,它们对FA通路的激活起关键作用。FANCM是FA核心复合物的组成元件,它与两个辅助因子,MHF1和MHF2,相互作用并共同定位到染色体上。FANCM/MHF1/MHF2复合物在ICLs识别中起作用,并能招募FA核心复合物在染色体上的装配。本文以FANCM/MHF1/MHF2复合物为研究对象,解析了MHF1/MHF2以及FANCM661-800/MHF1/MHF2复合物的晶体结构。结构显示MHF1和MHF2都具有典型的组蛋白折叠结构,以头尾相接的方式形成异二聚体,并进一步形成(MHF1-MHF2)2四聚体。相较于组蛋白(H3-H4)2四聚体,(MHF1-MHF2)2四聚体有着更致密的结构,主要由分子内疏水作用和特殊的四聚体作用面导致。胞内免疫共沉淀和荧光实验显示(MHF1-MHF2)2四聚体是其发挥功能的基本单位,任何结构上的破坏都将导致复合物组装的失败。FANCM通过两个串联的“V”型结构结合(MHF1-MHF2)2四聚体,并与之形成了巨大的作用界面。结构分析和功能研究结果表明,FANCM和MHF有协同结合DNA能力,除了(MHF1-MHF2)2四聚体经典的L1L2结合位点外,FANCM与(MHF1-MHF2)2结合后形成了一个新的DNA结合位点。通过结合DNA,(MHF1-MHF2)2四聚体帮助FANCM在染色体上的定位。而在FA病人体内发现的FANCMS724X终止突变,破坏了FANCM的双“V”结构的形成,使只有N端“V”结构域的FANCM不能有效地结合MHF,也从而无法完成染色体定位,这可能导致了FA的发生。细胞除了能精确去除突变,它们还可以保留畸变而完成DNA复制,这被称为DNA损伤容限(DNA damage tolerance, DDT),是一种保守的保护机制,普遍存在于原核和真核细胞中。在酿酒酵母中,DDT存在两条平行的下游通路：个是易错型(TLS),另一个是无错型通路(error-free DDT)。PCNA蛋白的单泛素化修饰激活了前者,其多泛素化修饰激活了无错型通路。无错型通路需要同源重组装置,利用新复制的姐妹染色单体做模板,实现DNA的突变跨过性复制,但是这个通路的具体分子机制还不清楚。酿酒酵母Shu复合物被认为在无错型DDT中起作用,它将同源重组和error-free PRR偶联起来。Shu复合物其实是同源重组拮抗蛋白Srs2的调节因子,通过抑制Srs2的活性促进了同源重组修复。Shu复合物含有四个亚基——Shu1、Shu2、Psy3和Csm2,只有完整的Shu复合物才能在DNA损伤修复中起作用。虽然Shu复合物有着重要的作用,但其发挥作用的分子机制还一无所知。我们解析了Psy3-Csm2复合物的晶体结构,发现它们虽然一级序列同源性很低,但却拥有类似的三级结构,和Rad51的结构高度相似。结构分析发现Psy3通过一个疏水核心同Csm2形成稳定的异二聚体。与Rad51一样,Psy3和Csm2结构中都含有一个富含碱性残基的L2loop。Psy3和Csm2的L2loop都是DNA结合motif,介导了Shu复合物和DNA的相互作用。Shu复合物通过非特异性地结合DNA,似乎形成了核酸蛋白纤维样结构。通过酵母表型实验,我们得出：Shu复合物的DNA结合活性是它抵抗甲基磺酸(Methyl methanesulfonate, MMS)造成的损伤所必需的。Shu复合物可能通过结合DNA被招募到损伤位点以调节Srs2的活性而发挥功能。