【摘 要】
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目的:探索泛素化特异性蛋白酶-3（ubiquitin-specific protease 3,USP3）在骨肉瘤中的生物学功能及其具体分子调控机制。方法:通过TIMER 2.0网站（http://timer.comp-genomics.org/）分析USP3在多种肿瘤中的表达差异。分别采用WB（western blot）和RT-q PCR（Real-time quantitative PCR）技术
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目的:探索泛素化特异性蛋白酶-3（ubiquitin-specific protease 3,USP3）在骨肉瘤中的生物学功能及其具体分子调控机制。方法:通过TIMER 2.0网站（http://timer.comp-genomics.org/）分析USP3在多种肿瘤中的表达差异。分别采用WB（western blot）和RT-q PCR（Real-time quantitative PCR）技术检测USP3在骨肉瘤组织和瘤旁组织中的表达差异;通过泛素化组学测序寻找USP3的下游靶蛋白;利用TARGET儿童肿瘤数据库分析EPHA2表达水平与骨肉瘤生存预后的关系。免疫组化染色评分分析USP3和EPHA2表达水平与骨肉瘤患者临床预后的相关性;通过基因干扰技术,干扰骨肉瘤细胞中USP3或EPHA2的表达;体外采用CCK-8、Migration、Transwell等实验分别观测细胞的增殖、迁移和侵袭活性;体内采用裸鼠皮下成瘤检测骨肉瘤的增殖能力,尾静脉注射肿瘤细胞构建远处肺转移模型检测骨肉瘤的侵袭转移能力;机制分析采用Co-IP（Co-Immunoprecipitation）、体内泛素化实验等检测USP3和EPHA2的泛素化水平以及两者之间的相互作用。WB检测USP3对PI3K/AKT信号通路的调控作用。结果:1.USP3在骨肉瘤中高表达,与患者的转移相关:通过生物信息学分析发现USP3在多种肿瘤中呈高表达状态,但是未找到USP3在骨肉瘤中的表达数据。检测USP3在新鲜骨肉瘤组织和瘤旁组织的表达差异。结果发现,相较于瘤旁组织,USP3在骨肉瘤组织中的表达水平显著更高。分析USP3表达水平与临床参数的相关性发现,肺转移组患者的肿瘤组织中USP3表达量相较于非肺转移组显著要更高,晚期（III/IV级）患者的USP3表达量要比早期（I/II级）患者显著更高。2.USP3在体内和体外促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭转移:分别敲低骨肉瘤细胞系143B和HOS中USP3的表达量后,骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性受到明显抑制;相反,过表达骨肉瘤细胞中USP3后,明显促进了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。体内动物实验发现,下调USP3后裸鼠皮下瘤体生长能力明显减弱,远处肺转移病灶更少。3.USP3去泛素化修饰调控EPHA2,激活PI3K/AKT信号通路,促进骨肉瘤增殖和侵袭转移:泛素化组学结果显示,下调USP3的表达量后,有116个蛋白的泛素化水平增高,排在前五位的分别是RAD18、EPHA2、ITG2C、PFN1、USP5。生物信息学分析这5个基因的单基因表达水平与骨肉瘤生存预后关系,结果显示只有EPHA2的表达量水平与骨肉瘤患者预后生存相关。下调或上调骨肉瘤细胞USP3表达量后,EPHA2的蛋白水平相应的下调或上调,但是EPHA2的m RNA表达水平无明显改变。CO-IP技术检测发现EPHA2与USP3相互特异性结合。此外,通过使用放线菌酮（CHX,cycloheximide）抑制蛋白质的合成来示踪蛋白的降解速度;结果发现,下调USP3可以加快EPHA2蛋白的降解速度。反之,上调USP3抑制EPHA2蛋白的降解速度。检测EPHA2在新鲜骨肉瘤组织和癌旁组织的表达差异,发现相较于瘤旁组织,EPHA2在骨肉瘤组织中的表达水平更高。单因素统计分析发现EPHA2表达量水平与远处转移和临床分期相关。敲低143B和HOS细胞中EPHA2的表达量后,明显抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性;相反,过表达143B和HOS细胞中EPHA2的表达量后,显著促进了骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力。过表达USP3,促进了PI3K/AKT信号通路的激活,在此基础上敲低EPHA2,PI3K/AKT信号通路受到抑制,并且骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭活性也受到抑制。结论:1、USP3在骨肉瘤中显著高表达;2、USP3去泛素化修饰调控EPHA2蛋白稳态,激活PI3K/AKT信号通路,促进骨肉瘤的侵袭转移;3、USP3作为一个肿瘤标志物,有望成为指导临床治疗骨肉瘤患者的新靶点。
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