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雄性不育材料因其为农业生产上异花授粉减少了人力、财力和物力,而广泛应用于杂交育种。因此,研究花药和花粉发育的机制,对作物遗传育种和提高农业产量等方面具有重要的意义。前人的研究表明AtMS2能控制花粉外壁的发育,在其突变体中发现花粉外壁发育异常会导致雄性不育。因此,我们围绕甘蓝型油菜和拟南芥的MS2展开一系列的功能研究,本研究的主要结果如下: 1、通过氨基酸比对发现在拟南芥和甘蓝型油菜中MS2的相似性达94%,选取与油菜BnMS2干扰片段序列相似性为97.69%的AtMS2设计干扰片段,用农杆菌介导的遗传转化法将AtMS2的RNAi载体转入拟南芥,获得T1代RNAi-AtMS2阳性转基因拟南芥6棵。 2、对T2代转基因拟南芥进行分子鉴定和表型观察,发现T2代转基因拟南芥和野生型拟南芥的花器官形态存在明显的差异。野生型拟南芥花型饱满,而转基因拟南芥的花瓣较小且萎缩,花丝短小,矮于雌蕊,花药薄而干瘪,且花药表面无明显的花粉附着,其他花器官组织与野生型无明显差异。通过醋酸洋红染色发现拟南芥野生型花粉外表面光滑,有一圈明显的花粉外壁,而转基因拟南芥中出现了完全不规则的花粉形态,花粉粒皱缩,表面有明显的凹槽,无明显的花粉外壁。通过观察角果发现,野生型拟南芥种子饱满,呈椭圆形,整齐排列在角果中,而转基因拟南芥形成的角果内不能产生种子或出现干瘪的种子且在角果内排列散乱无法形成成熟的角果。初步推测在拟南芥中干扰MS2后可能会引起花粉外壁发育异常,导致拟南芥雄性不育的发生。 3、进一步对T2代拟南芥不同时期花苞进行细胞学分析,发现T2代转基因拟南芥花药在花粉母细胞时期绒毡层开始降解,且减数分裂发生异常,不能形成正常花粉,从而导致花药败育。 4、对BnMS2在根、茎、叶、花、以及不同发育时期种子的表达量进行了分析,发现BnMS2在根、茎、叶片和花中的表达量极低,而在花苞中的表达量最高。 5、对BnMS2蛋白进行体外表达,western blot结果表明BnMS2的蛋白大小在58kDa-80kDa之间。 6、利用烟草表皮瞬时表达系统对BnMS2蛋白进行亚细胞定位分析,确定BnMS2定位于细胞膜和细胞质上。 7、利用农杆菌介导的遗传转化法将BnMS2的干扰载体转入甘蓝型油菜受体“扬油9号”(Y9)中,对T0代的转基因植株进行了分子鉴定和表型鉴定,通过观察花器官形态发现,与对照Y9相比,转基因甘蓝型油菜的雄蕊较短,花药也较小,其他花器官并无明显差异。利用醋酸洋红染色花粉粒,发现Y9的花粉粒呈圆形,花粉外围有一圈明显的花粉外壁,外壁光滑,花粉外壁上有柱状层和顶盖层;而转基因甘蓝型油菜的花粉外壁粗糙,柱状层和顶盖层模糊不清,与Y9的花粉相比,染色较浅,说明其花粉活性较低,初步推测BnMS2能够调控油菜花粉外壁的发育。 8、进一步对RNAi-BnMS2甘蓝型油菜不同时期花苞进行细胞学分析,发现绒毡层降解延迟。 本研究通过对RNAi-BnMS2转基因甘蓝型油菜进行分子鉴定和表型鉴定,初步推测BnMS2可能参与调控花粉外壁的发育。BnMS2定位于细胞膜和细胞核上。在甘蓝型油菜中干扰BnMS2,降低花粉活性,导致花粉外壁发育异常。说明MS2参与调控植物的花粉外壁的发育。