背景和目的鼻咽癌是一种发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤,其恶性程度较高,且具有极强的转移能力。我国是鼻咽癌发病率最高的国家,以广东、广西、湖南、福建等南方地区为著。放射治疗是鼻咽癌的重要根治性手段,尽管放疗技术的进步是使得鼻咽癌患者5年生存率和无病生存率明显提高,但仍不尽人意。microRNA (miRNA)是一类长度在22nt左右的内源非编码小RNA,广泛存在于动物、植物和病毒等多种有机体中,并在动物与植物的发育成熟、疾病的发生、发展及治疗方面起重要作用。近来研究表明,一些在调节细胞侵袭和干细胞样特性方面起重要作用rniRNA已成为肿瘤预防和治疗的重要靶标。新一代的高通量测序技术被广泛运用于1niRNA的发掘。这种高通量的测序技术得以大量发现非保守及表达量较低的miRNA。至目前为止,miRBase数据库中收集的193个物种的成熟miRNA中有7384条序列来自于植物,其中包括337条拟南芥miRNA,713条水稻miRNA和43条大白菜miRNA。研究显示,植物miRNA能通过进入哺乳动物体内并起作用。Zhang等人的研究结果显示植物miRNA同样能在人、小鼠及小牛的血浆中被发现,并能通过结合至哺乳动物的靶]mRNA的外显子区域抑制靶基因蛋白表达。因此,我们初步假设西兰花能通过rniRNA影响肿瘤细胞生物学效应。上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间充质表型细胞的生物学过程,是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程,是肿瘤转移的重要阶段。EMT的发生表现为上皮源性的肿瘤细胞失去细胞极性,细胞间的连接变得疏松,胞内骨架蛋白发生重组；转录因子Snail、Slug和Twist表达上调,上皮标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)和紧密连接蛋白ZO-1(zonula occluden-1)等表达下调；间质标志物波形蛋白(vimentin)和N型钙粘蛋白(N-cadherin)等表达上调。这一系列的改变导致肿瘤细胞的黏附能力下降,迁移运动能力增加,使得肿瘤细胞更易于离开原有位置；并使细胞获得干细胞样特性成为肿瘤干细胞。人交界粘连分子(unctional adhesion molecule-A, JAM-A)是位于细胞间的跨膜紧密连接蛋白,它在细胞的侵袭、血小板聚集和淋巴细胞粘附等方面起重要作用。研究显示,JAMA蛋白能激活细胞中Rap1(小分子G蛋白Ras超家族成员之一)显著影响与细胞粘附功能密切相关的E-钙粘蛋白等表达。更重要的是,在肿瘤转移及EMT等过程中扮演重要角色的PI3K/Akt通路能被Rap1激活。因此,我们假设JAM-A能通过PI3K/Akt通路影响肿瘤EMT特性。十字花科植物包含大量蔬菜,其中包括西兰花、花椰菜、甘蓝和芥菜等。研究显示,十字花科植物具有较好的抗肿瘤效果。西兰花是起源于意大利的甘蓝,流行病学研究显示十字花科植物能显著降低肿瘤的发生,尤其是肺癌、胃肠道癌症和前列腺癌。最近研究显示西兰花中含有攻击肿瘤细胞的化合物。总之,已经有大量研究显示西兰花具有明显的抗肿瘤作用,且有报道显示,植物rnicroRNA能通过微囊进入体内降低哺乳动物体内甘油三酯含量,目前尚未有西兰花通过microRNA影响肿瘤细胞生物学行为报道。因此,以前人研究报道为基础,我们假设西兰花能通过其中的miRNA影响肿瘤细胞生物学行为。我们首先研究了西兰花中miRNA’情况,找到其中可能的具有抗肿瘤的miRNA进行进一步的研究。方法第一章高通量测序检测西兰花中miRN及其生物信息学分析方法的建立1.西兰花总RNA提取与鉴定将组织在液氮中磨成粉末后,参照Trizol说明提取西兰花中总RNA。2.测定RNA浓度度及完整性。3.西兰花RNA电泳鉴定使用15%的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶对提取的西兰花中总RNA进行电泳检测；AgilentBioanalyzer分析所获得的RNA完整性。4.对完整性及浓度合格的RNA进行小、RNA (small RNA, sRNA)建库：分离得到18-30nt大小片段,连接5’端接头及3’接头,反转录为cDNA并行PCR扩增,上机测序最后由华大基因研究所完成。5.荧光定量PCR验证测序获得的西兰花中保守及新鉴定的miRNA。6.西兰花中miRNA高通量检测完成后生物信息学分析首先对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量读本的处理；通过SOAP程序将上述所得到的clean sRNA与大白菜(Brassica rapa, B.rapa)基因组比对,将所获得的sRNA定位至基因组；进一步对所获得的sRNA进行注释比对,最后鉴定已知miRNA及新miRNA。7.采用SPSS20.0统计学软件进行数据分析。荧光定量RT-PCR检测西兰花中rniRNA含量、植物miRNA在根茎叶中表达差异及rniRNA在哺乳动物体内含量情况采用单因素方差分析(One-way ANONA);多重比较采用LSD方法(方差齐性)及Dunett’T3(方差不齐)。P<0.05为有统计学差异,数值大小以均值±标准差(x±s)来表示。第二章细胞间紧密连接蛋白JAM-A对鼻咽癌细胞株EMT的影响1.JAMA质粒构建及过表达细胞株建立首先从CNE2细胞株基因组中克隆得到完整的目的基因(JAM-A CDS区)。T4连接酶连接酶切成功的载体及克隆产物。对连接成功产物进行扩增、鉴定并行测序验证；病毒包装成功后感染细胞。2.划痕实验用10ul无菌枪头沿培养皿底对培养密集细胞呈“一”字形划痕,加入无血清培养基继续培养,倒置显微镜下拍照观察。3. Transwell及Boyden检测转染前后细胞侵袭能力。4. Western blotting检测与EMT相关蛋白表达。5.免疫组化免疫组化分析172例鼻咽癌组织标本,并行统计分析。6.统计学方法采用SPSS20.0统计学软件进行数据分析。JAM-A上调和下调影响鼻咽癌细胞株EMT发生(2.5和2.6)中数据采用单因素方差分析(One-way ANONA);多重比较采用LSD方法(方差齐性)及Dunett’T3(方差不齐)。JAM-A影响细胞株放疗抵抗及对信号通路影响(2.7及2.8中数据)采用析因设计的方差分析。P<0.05为有统计学差异,数值大小以均值±标准差(x±s)来表示。临床数据采用卡方检验；临床病理中JAM-A表达与预后关系采用Kaplan-Meier及log-rank进行统计分析。第三章miR156a通过JAM-抑制鼻咽癌细胞株EMT1.CCK-8法了解miR156a合适浓度胰酶消化细胞后计数细胞,铺板。予不同不同浓度miRNA156a处理细胞,区不同时间时间点检测CCK8数值。2.生物信息学分析在miRBase中查找西兰花同种属miR156a序列；结合南京大学zhang等人预测条件,由华大基因完成。3.靶基因目的片段的获取利用PCR反应克隆目的片段,酶切psiCHECK2质粒及PCR产物,并连接测序；定点突变参照碧云天突变试剂盒完成。4.细胞转染实验参照第二部分完成。5.双荧光素酶报告基因检测miR156a对JAM-A基因3’UTR区的结合作用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值验证3’-UTR靶向结合位点活性。6.统计学方法采用SPSS20.0统计学软件进行数据分析。MiR156a抑制鼻咽癌细胞株EMT、靶基因验证均采用采用单因素方差分析(One-way ANONA);多重比较采用LSD方法(方差齐性)及Dunett’T3(方差不齐)。P<0.05为有统计学差异,数值大小以均值±标准差(x±s)来表示。结果第一章高通量测序检测西兰花中miRNA及其生物信息学分析方法的建立1.西兰花中sRNA的分析成功构建西兰花sRNA文库后对所测数据的sRNA序列长度进行分布统计,其中24-nt sRNA含量最高；其次是22和23-ntsRNAs。将西兰花sRNA与B.rapa基因组匹配,基因定位分析显示,这些sRNA几乎均匀的分布在A1至A13染色体上。2.西兰花中保守miRNA的高通量分析西兰花中检测到了84条保守存在于多种植物中的miRNA在。半定量RT-PCR验证miR156a, miR168a和miR157d在西兰花中表达量最高,而miR165a-3p表达量相对较低。3.西兰花中新miRNA的预测我们共鉴定了西兰花中184条新miRNA。这些新miRNA平均拷贝数为130,明显低于保守miRNA平均拷贝数。依据Mfold测算结果,新miRNA前体形成二聚体的平均最小自由能为-47.8kcal/mol(-18.5至-123kcal/mol)。4.植物miRNA在根、茎及叶中差异表达miR156a, miR168a和miR172b在花、茎和叶中表达量较高。尽管miR156a在所有组织中广泛表达,但在花和叶中表达量最高。第二章细胞间紧密连接蛋白JAMA对鼻咽癌细胞株EMT发生的影响1.成功构建JAM-A过表达质粒为构建JAM-A过表达质粒,首先从鼻咽癌细胞株中提取获得基因组DNA,扩增获得JAM-A CDS区域。质粒酶切PCR产物及载体质粒,连接、测序成功后感染病毒,成功获得过表达质粒。2.异位过表达JAM-A能在体外诱导EMT的发生并增加鼻咽癌细胞的侵袭和迁移能力。Transwell检测结果显示,每高倍镜下CNE2细胞数量从对照组的12.47增加至JAM-A过表达组的26.23(F=225.6,P<0.01)。划痕实验检测的愈合指数同样明显增加,划痕24小时后,愈合指数从对照组的47%增加至JAM-A过表达组的62%(F=20.53,P=0.02)。Western blotting结果显示,上皮细胞标记物a-Catenin和E-cadherin减低,而Vimentin表达量升高。3.下调JAM-A表达能抑制鼻咽癌EMT发生我们设计的JAM-A shRNA#1和shRNA#2均能下调鼻咽癌细胞株中JAM-A表达。JAM-A下调后,CNE2和HONE1中E-Cadherin表达明显上升,Vimentin表达量明显下降。划痕实验结果显示,JAM-A下调能减低鼻咽癌细胞株愈合指数及鼻咽癌细胞株侵袭能力。随着JAM-A的下调,鼻咽癌细胞株球囊形成数量、软琼脂克隆形成能力明显下降。4. JAM-A高表达患者远处转移率明显升高,预后显著差于JAM-A阴性患者。为进一步研究JAM-A表达水平在鼻咽癌病人中的重要性,我们利用免疫组化法分析了172例确诊为鼻咽癌患者的JAM-A表达水平。结果显示,JAM-A主要在细胞膜及少量胞浆中表达。Kaplan-Meier以及log-rank分析JAM-A表达与总生存及无病生存率分析结果显示,高表达JAM-A蛋白总生存明显差于JAM-A阴性组(P<0.01)。另外,JAM-A高表达组的5年无病生存率明显短于JAM-A阴性组(P<0.01)。第三章miR156a通过JAM-A抑制鼻咽癌细胞株EMT1.体外实验结果显示,植物miR156a能抑制鼻咽癌细胞株EMT和干细胞样特性为了初步研究西兰花miR156a能否抑制肿瘤EMT, Transwell和Boyden检测结果显示,miR156a能抑制鼻咽癌细胞株CNE2和HONE1侵袭能力。Western blotting分析显示,转染miR156a后,a-Catenin和E-cadherin表达水平明显升高,Vimentin减低。2.生物信息学预测miR156a靶基因及双荧光素酶报告载体验证生物信息学方法预测了miR156a40个可能的靶基因。双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR156a能结合至JAM-A mRNA3’UTR区域。在鼻咽癌细胞株和293T细胞株中,共转染miR156a和JAM-A-3’UTR组,减低了荧光素酶报告基因的表达翻译,荧光强度明显减弱,转录阴性对照或psiCHECKTM-2/JAM-A/mut的共转体系,下游荧光素霉报告基因可以表达,产物荧光强度较高。3. MiR156a通过JAM-A诱导鼻咽癌细胞株EMT鼻咽癌细胞株转染miR156a mimic后JAM-A蛋白表达减低,而上皮细胞标记物E-cadherin表达上升。结论1.西兰花中存在大量sRNA,其中以21nt miRNA和24nt siRNA含量最多;通过高通量测序方法检测发现了西兰花中84条保守miRNA和184条新miRNA。2. miRNA156a在西兰花根、茎及叶中均有表达,在花中表达量最高。3. JAM-A能在体内及体外诱导鼻咽细胞株EMT的发生。鼻咽病理组织结果显示,高表达JAM-A与鼻咽癌病人不良预后及远处转移明显正相关性。4. miR156a能通过结合至JAM-A mRNA的3’UTR区抑制鼻咽癌细胞株EMT表型和干细胞样特性。