临床输血治疗是最常用的细胞治疗手段,然而目前血液来源紧张及输血相关传染病发生给其临床应用的安全性和广泛性带来了巨大挑战,因此人们期望寻找更为安全、充足的血液来源。随着干细胞发育及体外诱导分化研究的不断深入,大量的研究表明人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hES细胞)在体外能够诱导分化为成熟红细胞作为新的血液来源,这种全新的血液替代来源有可能为解决目前临床输血治疗面临的问题带来希望,因此以hES细胞为启动细胞的造血细胞工程研究备受国内外关注,并具有广泛的应用前景和重大的社会经济效益。目前,体外大规模诱导hES细胞分化为成熟红细胞并最终应用于临床还有很多关键的技术问题需要解决,包括如何安全低成本的大规模扩增hES细胞,如何高效率诱导hES细胞向红系细胞分化,如何高效率的使红系细胞成熟并脱核,诱导分化成熟的红系细胞是否能够在体内发挥功能,诱导获得红细胞的安全性和免疫排斥等问题。在以上问题中,本研究拟通过实验研究解决其中两个关键性技术问题,实现安全低成本的扩增hES细胞和体外无血清培养体系下高效率的扩增红系祖细胞并向脱核红细胞分化。希望通过解决以上两个关键技术问题使hES细胞向成熟红细胞分化能够更安全、高效,为最终诱导hES细胞分化为成熟红细胞解决临床输血治疗面临的问题奠定实验基础。本研究主要包括两部分内容。一、利用bFGF-hFLSCs作为人源化饲养层细胞体外扩增hES细胞hES细胞建系和常规培养都是用小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)做饲养层细胞或用MEF条件培养基(MEF conditional medium, MEF-CM)添加细胞因子在无饲养层条件下培养hES细胞,这种异基因来源的饲养层给hES细胞的应用带来很大的安全风险。为避免动物源性饲养层可能带来的污染,我们分离获得了14周胎龄的人胎肝基质细胞系(human fetal liver stromal cells, hFLSCs),其在体外可以长期培养扩增,能够传代35次仍保持正常的核型,形态学及其表面标志表达均类似人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)。hFLSCs作为饲养层细胞可以维持hES细胞的增殖传代达10-15次,hFLSCs饲养层培养的hES细胞经RT-PCR和免疫荧光检测均表达hES细胞特异性的标志,并保持其干性特征。免疫荧光结果表明hFLSCs和克隆边缘分化hES细胞均表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的受体成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor1, FGFR1),而未分化hES细胞表达胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor, IGF1R),提示bFGF通过作用于饲养层细胞和克隆边缘少量分化的细胞来发挥其干性维持的作用。bFGF是hES细胞体外培养中唯一必需的细胞因子,其在hES细胞的干性维持中发挥着关键的作用。为建立稳定表达bFGF的hFLSCs,我们首先从hMSCs中用RT-PCR扩增出bFGF基因,将其连入慢病毒载体pBPLV,构建bFGF的慢病毒表达载体bFGF-pBPLV,在293-FT细胞中包装病毒后转染hFLSCs。为了获得bFGF分泌量更高的hFLSCs,我们将转染后的hFLSCs用流式细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)分为弱荧光表达和强荧光表达的两群细胞,我们将强荧光表达的命名为bFGF-hFLSCs,弱荧光表达的命名为Low-bFGF-hFLSCs。bFGF-hFLSCs在形态学、表面分子表达及生长特性等方面与hFLSCs相比无明显变化,用RT-PCR、Western blot和ELISA等方法证明bFGF-hFLSCs可以长期稳定表达bFGF蛋白。进一步的研究则表明,bFGF-hFLSCs作为饲养层细胞能在不添加外源bFGF时维持hES细胞生长,hES细胞在bFGF-hFLSCs上培养可以传代10-15代,并对传代培养的hES细胞从多个方面进行了鉴定,包括RT-PCR和免疫荧光检测特异性标志表达,通过拟胚体(embryoid body, EB)形成验证其体外多向分化能力,RT-PCR和免疫荧光检测了三个胚层特异性标志的表达,结果均表明bFGF-hFLSCs上培养扩增的hES细胞保持了其自我更新和多向分化能力。我们对bFGF-hFLSCs体外维持hES干性的机制进行了初步研究,通过RT-PCR和Western blot检测结果表明bFGF-hFLSCs与hFLSCs相比其IGF2表达明显上调,RT-PCR检测表明bFGF-hFLSCs与hFLSCs相比其TGF-β、FGFR1和IGF1R的表达均出现上调。结果提示我们bFGF-hFLSCs可能通过分泌IGF2和TGF-β等细胞因子与hES细胞表面的IGF1R和其他受体结合,发挥其干性维持作用。在本部分实验中我们利用bFGF-hFLSCs作饲养层细胞培养hES细胞,建立了一个人源化不需添加外源bFGF的体外扩增hES细胞培养体系,降低了培养成本,提高了安全性。同时我们对bFGF-hFLSCs维持hES细胞干性的机制进行了初步探讨。二、诱导hES细胞向造血干/祖细分化及诱导造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)分化为成熟红细胞为了建立诱导hES细胞体外分化为成熟红细胞的技术,我们在改进hES细胞培养体系的基础上,将hES细胞在细胞因子的作用下通过形成EB的方法使其向造血细胞诱导分化,可以获得早期的血液血管干细胞(hemangioblst, HA)和造血干/祖细胞。从诱导第4天的EB细胞中,用半固体克隆培养得到HA体外培养的BL-CFC(blast-clony forming cells)克隆,BL-CFC可以继续分化为内皮样细胞和造血细胞。从诱导第14天的EB内获得CD34+造血干细胞的比例可以达到9.54%,hES细胞来源的CD34+细胞在半固体克隆形成实验时可以向各系造血细胞分化,并能够在体外继续增殖和进一步分化。诱导获得的造血干/祖细胞能够作为继续向成熟细胞诱导分化的起始细胞,由于hES细胞具有理论上的“无限”增殖能力,因此可以从hES细胞获得充足的造血干/祖用于后续的成熟红细胞分化。为了建立高效的红系祖细胞诱导分化体系,我们利用脐带血来源HSCs作为起始细胞,在无血清培养体系下高效率诱导其分化为红系祖细胞,结果表明细胞能够维持扩增达50天,细胞数量扩增108-109倍,诱导来源的红系祖细胞通过形态学观察、瑞氏-姬姆萨染色、流式细胞术检测表面标志和半固体克隆形成实验等方法加以证明,从而表明在该体系下可以特异性的扩增红系祖细胞。近来的研究表明将红系祖细胞与基质细胞共培养是体外诱导其脱核的高效方法,而胎肝是胚胎期红系细胞发育成熟的重要器官,我们分离了24周胎龄hFLSCs,对其表面标志和细胞体外增殖等特性进行了鉴定,然后将诱导获得红系祖细胞与hFLSCs共培养,实现了红系祖细胞的高效率脱核,脱核比例能够达到80%-90%。利用RT-PCR检测了HSCs向脱核红细胞分化时不同时间点的血红蛋白表达模式,结果表明在mRNA水平与hFLSCs共培养获得的红细胞高表达成体β血红蛋白,而不表达胚胎期和胎儿期的ξ和ε血红蛋白。同时用RT-PCR检测了不同时间点红系发育相关的转录因子SCL/TAL-1、PU-1和GATA-1的表达情况,初步证明与hFLSCs共培养的诱导分化模型可以模拟正常的红系发育,并有望用于规模化的红细胞诱导成熟和红系发育分化的机制研究。总结本研究针对hES细胞向成熟红细胞分化过程中的两个关键技术问题开展了实验研究,首先用转基因的bFGF-hFLSCs作为饲养层实现体外人源化低成本的扩增hES细胞,为hES的诱导分化提供充足的种子细胞。同时诱导hES细胞分化为HA和HSCs,并在无血清体系诱导脐带血来源HSCs高效特异地向红系祖细胞分化,进而通过红系祖细胞与基质细胞的共培养,高效率诱导红细胞脱核,最终形成成熟红细胞。这些研究结果将为最终实现hES细胞体外诱导分化为成熟红细胞作为血液替代来源奠定实验基础。