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MicroRNAs是一系列进化保守的单链小非编码RNA分子,广泛存在于生物体各个部位,并参与调节机体的生长、发育、凋亡等生理过程。在众多miRNA中,miR-101-3p是一种肿瘤抑制因子,参与了许多与肿瘤相关的生物学过程,包括增殖、凋亡、血管生成、耐药性、侵袭和转移。课题组前期研究结果表明miR-101-3p在产单羔和多羔奶山羊的卵巢中差异表达显著,表明miR-101-3p对卵泡的生长发育有重要的调控作用。但miR-101-3p及它的靶基因是如何调控卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡和分泌功能的尚未见报道。因此,本试验以关中奶山羊卵巢颗粒细胞为研究对象,利用高通量测序、ELISA、CCK-8、EdU、流式细胞术、荧光探针原位杂交、免疫组化、HE染色等技术,通过干扰、过表达以及共表达方法研究了miR-101-3p通过靶基因STC1调控颗粒细胞激素分泌、细胞增殖、细胞凋亡的机理。主要研究结果如下:1.过表达miR-101-3p的卵巢颗粒细胞转录组测序在颗粒细胞中过表达miR-101-3p,通过高通量测序和生物信息学分析获得142个差异表达的miRNA。GO和KEGG富集分析获得对卵泡发育有调控作用差异表达的信号通路,如蛋白质消化吸收（Protein digestion and absorption）、细胞粘附分子（Cell adhesion molecules（CAMs））等。实时定量PCR验证筛选出的表达量最高的10个基因,结果表明,STC1、NDUFA4L2、C4BPA、FSHR、CNNM1和GUCY2C表达差异显著且与RNA-seq结果一致,LOC102189835、CLEC9A、KRT7、LOC102185049表达差异不显著但与RNA-seq结果趋势一致。2.miR-101-3p对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和分泌功能的调控作用miR-101-3p在奶山羊下丘脑、肌肉、卵巢、乳腺、肾、子宫、肺、肠、肝、心、垂体共11个组织均有表达,其中肺中表达量最高,心脏表达最低,卵巢中也有较高的表达。miR-101-3p在大卵泡（>3mm）、小卵泡（1-3mm）及黄体中都有表达,其中小卵泡和黄体的表达量较高。miR-101-3p通过调节类固醇激素STAR、CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD基因的表达促进颗粒细胞雌激素（E2）和孕酮（P4）的分泌。CCK8、EdU、流式细胞法检测细胞周期和细胞凋亡的结果显示,过表达miR-101-3p可以促进颗粒细胞凋亡,抑制细胞增殖;抑制miR-101-3p可以促进颗粒细胞增殖,抑制细胞凋亡。在mRNA和蛋白水平,miR-101-3p对细胞增殖相关基因CCND1、CCNE1、CDK4、PCNA以及细胞凋亡相关基因BAX、BCL2、P53、Caspase 3的影响与颗粒细胞增殖和凋亡的变化基本一致。miR-101-3p通过抑制PI3K/AKT通路中关键基因PI3K、PTEN、AKT和mTOR的磷酸化水平调节颗粒细胞增殖及颗粒细胞凋亡。3.miR-101-3p通过靶基因STC1对颗粒细胞调节机理的研究STC1在奶山羊下丘脑、肌肉、卵巢、乳腺、肾、子宫、肺、肠、肝、心、垂体共11个组织均有表达,其中在子宫中表达量最高,垂体中表达最低,卵巢中STC1也有相对较高的表达。STC1在大卵泡中表达比小卵泡和黄体高。采用高通量测序、生物信息学分析、双荧光素酶报告载体、实时定量和western blot分析的结果表明,STC1是miR-101-3p的靶基因。通过过表达、干扰和共表达方法验证miR-101-3p通过靶基因STC1调节类固醇激素STAR、CYP11A1、CYP19A1、3β-HSD基因的表达从而促进颗粒细胞E2和P4的分泌。CCK8、EdU、流式细胞法测细胞周期和细胞凋亡结果显示,miR-101-3p通过靶基因STC1调节细胞增殖相关基因CCND1、CCNE1、CDK4、PCNA以及细胞凋亡相关基因BAX、BCL2、P53、Caspase 3的表达,促进颗粒细胞凋亡,抑制细胞增殖。miR-101-3p通过靶基因STC1抑制PI3K/AKT通路关键基因PI3K、PTEN、AKT和mTOR的磷酸化水平调节颗粒细胞增殖及细胞凋亡。4.miR-101-3p及其靶基因STC1对小鼠卵巢发育的影响荧光探针原位杂交结果显示,在对照组中,miR-101-3p在小鼠的原始卵泡、排卵后黄体中表达较高,说明miR-101-3p在卵泡发育及排卵中有调节作用。在过表达miR-101-3p组中,miR-101-3p在卵巢的大部分区域表达明显,包括原始卵泡的膜细胞,次级卵泡、生长卵泡、成熟卵泡、排卵后的外膜细胞,排卵后由颗粒细胞形成的黄体,间质细胞都有大量的表达;在抑制miR-101-3p组中,miR-101-3p在卵巢中几乎不表达,只在局部的间质细胞中有少量的荧光。说明miR-101-3p的激动剂和拮抗剂效率较高,可以有效研究miR-101-3p在活体卵巢中的作用。免疫组化显示过表达miR-101-3p和干扰STC1都可以显著抑制STC1在卵巢中表达,抑制miR-101-3p可以显著上调STC1表达,实验组可以有效的研究STC1在卵巢中的作用。对小鼠卵巢HE染色后,发现过表达miR-101-3p和STC1干扰组卵巢个体偏小且发育迟缓,有腔卵泡的数量显著下降,卵泡发育异常;抑制miR-101-3p表达,可显著增加卵泡数量,卵巢发育正常。小鼠卵泡的发育状况与体外miR-101-3p促进颗粒细胞凋亡、抑制增殖结果相符。