捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)属毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)线虫,主要寄生于宿主皱胃(偶见于小肠),以吸食宿主的血液为生。由于虫体刺破胃粘膜吮血,可引起宿主皱胃黏膜的损伤,从而影响宿主的代谢,降低饲料利用率,并最终导致患畜贫血、腹泻和慢性消耗性衰竭,严重的甚至可以导致患畜死亡, 对畜牧业造成极大经济损失。半乳糖凝集素(galectins)是一种广泛分布于脊椎动物和无脊椎动物中的S型凝集素。它们功能多样,参与细胞凋亡、细胞粘附、细胞增殖、细胞因子分泌和免疫反应等多种生物学过程,并可作为模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)在宿主免疫细胞与病原的相互作用中发挥作用。此前,我们分别从捻转血矛线虫的雄虫和雌虫中克隆鉴定了Hco-gal-m (Ace. No. AY253330)和Hco-gal-f (Acc. No. AY253331)两种galectins.生物学功能研究发现,Hco-gal-m/f能够诱导山羊淋巴细胞的凋亡,抑制淋巴细胞中细胞因子的转录。同时,Hco-gal-m/f具有免疫保护性,用重组蛋白(rHco-gal-m/f)免疫过的山羊在人工感染捻转血矛线虫后,排虫卵量和荷虫数显著降低,血清中IgG的含量大幅提高。所有这些证据表明,Hco-gal-m/f对宿主的免疫反应具有重要的调节能力。但是,其作用的分子机制目前还知之甚少。因此,我们在先前的工作基础上进行了以下研究：1.捻转血矛线虫半乳糖凝集素的发育表达与组织分布为了研究捻转血矛线虫半乳糖凝集素(Hco-gal-m/f)在不同发育时期的虫体中的表达水平,我们根据已报道的基因序列设计合成了特异性引物,以卵、三期幼虫、脱壳三期幼虫、四期幼虫以及成虫的cDNA为模板进行real-time PCR检测,发现Hco-gal-m/f基因在卵和三期幼虫中几乎无表达,在四期幼虫时出现表达,在成虫中表达量最高,且在雌虫的表达水平高于雄虫。同时,用重组捻转血矛线虫半乳糖凝集素蛋白(rHco-gal-m/f)免疫大鼠制备的抗血清进行Western blot检测,发现在捻转血矛线虫的不同发育时期Hco-gal-m/f在蛋白质水平的变化趋势与核酸水平的变化基本一致。此外,利用冰冻切片结合免疫荧光技术对Hco-gal-m/f在虫体中的分布进行组织定位。结果发现,Hco-gal-m/f主要分布在成虫小肠内壁微绒毛上,鲜见于其它部位。2.捻转血矛线虫半乳糖凝集素作周下山羊PBMC差异表达蛋白的研究及相关信号通路分析捻转血矛线虫半乳糖凝集素(Hco-gal-m/f)具有重要的免疫调节功能。为了研究Hco-gal-m/f调节山羊外周血单个核细胞(PBMC)免疫功能的分子机制,本文应用双向电泳和实时定量PCR的方法,对重组Hco-gal-m/f (rHco-gal-m/f)刺激前后的山羊PBMC进行差异蛋白筛选和相关信号通路分析。比较蛋白组的结果显示,rHco-gal-m/f刺激前后共有16个蛋白的表达发生显著变化。这些差异表达蛋白主要参与应激反应和细胞运动；15个蛋白(93.8%)具有结合活性,9个蛋白(56.3%)具有催化活性。对相关信号通路关键基因进行的定量PCR分析发现,rHco-gal-m/f’能够激活TLR通路和CASPASE通路,对于VEGF、NFκB和自由基产生等信号通路则表现出抑制作用。蛋白质组学结合基因表达分析为探寻Hco-gal-m/fi的作用靶位点和研究Hco-gal-m/f的免疫调节机理提供了新的线索。3.有丝分裂原活化山羊PBMC的蛋白组学研究及捻转血矛线虫半乳糖凝集素的抑制作用分析外周血单个核细胞(PBMC)在固有免疫和获得性免疫中具有重要作用, 而捻转血矛线虫半乳糖凝集素(Hco-gal-m/f)则是一类重要的免疫抑制分子。为了探索山羊PBMC的活化标志和分子机制,以及Hco-gal-m/f对细胞因子分泌的抑制作用,本文应用双向电泳和实时定量PCR对ConA活化前后及rHco-gal-m/f;刺激下的山羊PBMC进行差异蛋白分析和相关信号通路检测。比较蛋白组的结果显示,ConA刺激前后共有22个蛋白的表达发生显著变化,这些差异表达蛋白主要参与基质重建、肌丝聚合、转录起始、细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期调控等。定量PCR分析发现,ConA能够促进细胞因子及其受体、ERK1/2、P38、STAT和CDK等信号通路的活化,对SOCS和PIAS通路则表现出抑制作用。rHco-gal-m/f刺激后ConA活化的PBMC中共有5个蛋白发生显著变化,其中CAPG和LAP3的表达发生明显的反转,上述多条信号通路的活化受到干扰,除IL-10外的多种细胞因子、ERK1/2、P38和CDK通路的活化受到抑制,而SOCS1,3则转录增强。活化标志分子的鉴定和相关通路分析,不仅为研究病原感染过程中山羊PBMC的炎性活化提供新的线索,同时为研究Hco-gal-m/f的免疫抑制效应提供了理论基础和依据。4.捻转血矛线虫半乳糖凝集素对山羊外周血T细胞和单核细胞的不同调节作用单核细胞和T细胞是外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)的两个主要亚群,在固有免疫和获得性免疫中发挥重要作用。不同的半乳糖凝集素(galectins)分子对不同类型的细胞具有多种不同的调节效应。在本试验中,我们利用捻转血矛线虫半乳糖凝集素(Hco-gal-m)的重组蛋白(rHco-gal-m)对其在山羊外周血单核细胞与T细胞中的调节免疫调节作用进行了研究和分析。流式细胞术分析发现rHco-gal-m能够紧密地结合在单核细胞与T细胞表面。ELISA测试表明,rHco-gal-m能够抑制IL-6、IL-10和TNF-a等细胞因子在T细胞中的表达；但是在单核细胞中,rHco-gal-m却能诱导大量的IL-10产生。实时定量PCR分析证明,单核细胞和T细胞的活化同样能受到rHco-gal-m的抑制,两种细胞表面的活化标志分子MHC-II和CD25的表达水平显著降低。与此相应,T细胞的增殖亦被rHco-gal-m阻断。不仅如此,进一步研究发现rHco-gal-m能够引起T细胞的凋亡,且成剂量依赖性；而单核细胞却对rHco-gal-m的促凋亡作用并不敏感。总之,以上结果表明rHco-gal-m能作为一种免疫调节分子在宿主免疫系统中发挥重要作用,并对山羊外周血中的单核细胞和T细胞有着不同的调节模式。