研究背景近30年来，蛋白质免疫印迹（Western Blotting）一直作为一项常规实验技术，在生命科学研究领域中被广泛应用。其包括凝胶电泳分离，及后续的免疫检测两个主要步骤。Western Blotting主要用于蛋白质定性和半定量分析，即检测样品中目标蛋白的有无、或不同样品中目的蛋白的差异表达水平。在定性分析中，需首先检测泳道中是否存在蛋白，以排除系统非正常工作所导致的假阴性；而半定量分析时，则需要校正不同样品的上样量以及转印效率的差别造成的系统误差。为此，实验过程中往往需要引入合适内参（loading control）来作为体系对照。目前使用的内参主要有两种趋势，一种是采用传统的管家基因所表达的蛋白即管家蛋白进行免疫反应，将其发光灰度值作为体系内参；另一种则是采用全蛋白染色法，即将全部上样蛋白染色后的灰度值作为体系内参。直接蓝71（Direct Blue71，DB71）是一种工业常用的偶氮染料，2000年Hee-Youn Hong首次发现该染料在酸性环境下能进行蛋白染色，并且在弱碱性环境下易于洗脱。那么，DB71染色是否能作为一种Western Blotting内参，这种染色方法是否会影响后续的免疫反应，其在天然样本中的染色范围与线性程度等，这些问题均需进一步实验研究。目的本实验通过与传统的单一蛋白免疫内参和全蛋白染色内参进行比较，建立基于直接蓝71免洗脱染色的蛋白质免疫印迹内参。方法采用三种常见的神经科学研究样本（人血浆，人少突胶质瘤细胞，大鼠脑组织）系统评估DB71染色法作为Western Blotingt内参的可行性。其中，考马斯亮蓝作为传统的全蛋白膜染色内参法，β-tubulin作为传统的蛋白印记免疫内参法，维他命D结合蛋白作为日常实验中的目的蛋白来与DB71染色法进行对照试验。每种样本重复上样6次，采用相关系数评估其精确性；2.5-40μg的线性蛋白上样，采用R2来评估方法的线性及线性范围；共3次技术重复，采用独立样本T检验来评估DB71染色法与两组对照内参法的差异和可重复性。结果（1）在少突胶质瘤细胞组中，DB71染色法的精确性和可重复性较考马斯亮蓝膜染色内参法有统计学差异，而大鼠脑组织和人血浆组并未表现明显差异。（2）在少突胶质瘤细胞组和大鼠脑组织组中，直接蓝71染色法的精确性性和可重复性较β-tubulin免疫内参法有明显优势，差异有统计学意义。（3）在少突胶质瘤细胞组和大鼠脑组织组中，未洗脱的直接蓝71染色法的精确性和可重复性较未染色的β-tubulin组和维他命D结合蛋白组无统计学差异，结果表明未洗脱的直接蓝71对后续的免疫反应不会造成太大干扰。（4）在三组样本的2.5-40μg上样范围内，直接蓝71染色法线性好，与考马斯亮蓝染膜法和β-tubulin免疫内参法无统计学差异。在血浆样本中，直接蓝71染色法较维他命D结合蛋白组有统计学差异，而维他命D结合蛋白组线性较差，推测其可能在20μg已达到免疫线性上限。（5）在三组样本2.5-40μg上样范围内，未洗脱的直接蓝71染色法的线性范围较未染色的β-tubulin组和维他命D结合蛋白组无统计学差异，证明了未洗脱的直接蓝71不会影响常规上样范围内免疫动力学。结论DB71免洗脱染色法具有良好的线性范围，可以作为一种方便快捷且价格低廉的Western Blotting内参。