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经典猪瘟(classical swine fever,CSF)是由世界动物卫生组织(OIE)列出的猪中非常严重而且高度传染的猪类疾病。在我国,因感染CSFV死亡的猪占全部疫病致死猪的三分之一以上,造成大量的经济损失以及巨大的人力和资源的浪费。我国通常使用接种猪瘟弱毒疫苗的方法来预防猪瘟,降低发病率和死亡率,这些疫苗具有突出的安全性和疗效,但是缺乏从已接种动物中区分感染的能力。近年来,猪瘟的疫情由大范围的感染转变为地方性的爆发,疫苗免疫次数的增多和免疫剂量的加大,并不能按照预期有效而及时地控制住猪瘟的蔓延。此外,由于兔化弱毒苗的大量使用以及野毒株产生的变异,疫情出现慢性、隐性感染,以致疫情难以控制。因此,研发出能够快速诊断、安全、高效的新型亚单位疫苗是全世界养猪业的行业需求。为制备具有免疫原性的猪瘟病毒E2蛋白,本研究应用昆虫杆状病毒表达系统表达E2蛋白,随后进行E2蛋白的纯化、免疫原性分析以及糖基化水平的分析。研究中首先将E2基因插入载体pFastBacl,构建重组质粒pFastBac-E2。随后将重组质粒转化至DH10 Bac感受态细胞中发生特异性转座,从而得到重组穿梭载体(bacmid),提取bacmid并转染昆虫细胞sf21,收获杆状病毒并进行扩增,最终利用病毒感染sf21细胞,从而得到昆虫细胞表达的重组E2蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明本试验成功表达出重组的E2蛋白。在E2蛋白初步表达的基础上,分别进行CSFV E2蛋白的胞内表达和分泌表达,利用SDS-PAGE及猪瘟抗体检测试纸条分析蛋白表达水平,结果表明E2蛋白的分泌表达量高于胞内表达。进一步进行分泌表达条件的优化,通过对细胞密度、接毒量和接毒时间的摸索,最终确定蛋白表达最佳条件。随后通过金属镍填料纯化E2蛋白,并用分子筛进一步纯化,最终得到纯度较高的E2蛋白,1L细胞培养液可纯化得到27 mg的E2蛋白。利用SDS-PAGE分析纯化效果,结果表明纯化所得E2蛋白纯度较高,约达到90%～97%。将纯化后的E2蛋白添加弗氏佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠,采集血清进行CSFV抗体ELISA检测试验,结果显示,免疫后3周血清样本阻断率大于40%,表明小鼠体内产生了较高水平的CSFV抗体,从而证明E2蛋白免疫原性良好。本实验表达了两种具有去糖基化作用的N—糖酰胺酶F(PNGase F)及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶-F1(Endo-F1),利用纯化所得的这两种酶处理本研究表达所得重组CSFV E2蛋白,结果表明利用大肠杆菌表达系统得到的PNGase F和Endo F1具有高效的去糖基化作用,且杆状病毒表达所得CSFVE2蛋白糖基化水平较高。综上,本研究成功利用昆虫杆状病毒表达系统表达了可溶性E2蛋白,通过优化表达条件提高其分泌表达水平,最终纯化得到纯度较高的E2蛋白,其糖基化水平较高,免疫原性良好,从而为CSFV亚单位疫苗的研制奠定了基础。