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BCG腔内灌注是防治膀胱肿瘤的重要辅助手段,但其所致的膀胱局部与全身并发症使得BCG膀胱腔内灌注的应用受到一定的限制,本实验室成功研制的重组人IFN-α-2b-BCG是一种新型菌苗,与野生BCG比较,除了保留野生BCG的基本特性外,优势在于可以持续分泌IFN-α-2b, BCG和IFN-α-2b二者同时作用可以产生最佳的免疫诱导效应,抗肿瘤作用更明显,副作用发生较少,更适合病人长期灌注。对于BCG的抗癌作用机制,目前多认为与BCG对免疫系统的作用有关,Toll样受体是机体免疫系统的重要组成部分,通过识别并结合相应的病原相关分子模式启动激活信号转导途径,诱导某些免疫效应分子表达,并且通过TLRs信号通路介导肿瘤的免疫治疗。研究目的：本实验室在前期研究中,已证实了重组人IFN-α-2b-BCG在抗肿瘤生物学效应方面的作用优于野生BCG,并对TLR4在BCG诱导hPBMC的抗肿瘤效应作用中的表达及意义做了初步探讨,为进一步揭示重组人IFN-α-2b-BCG抗肿瘤生物学效应的机制,我们进行了以下两方面研究：第一部分主要探讨重组人IFN-α-2b-BCG诱导hPBMC分泌hTNF-α、hIL-12、hlFN-γ的剂量-效应作用关系。第二部分应用TLR4特异性功能阻断抗体深入研究重组人IFN-α-2b-BCG、野生BCG和干扰素对hPBMC的TLR4信号通路的调节及对TNF-α、IL-12、IFN-γ表达的影响。实验方法：第一部分：应用重组人IFN-a-2b-BCG对hPBMC进行免疫刺激,并用ELISA方法检测重组人IFN-α-2b-BCG刺激不同细胞浓度的hPBMC产生TNF-α、IL-12、IFN-γ表达量随时间的变化；以及不同细菌浓度时刺激三种细胞因子分泌的量效关系；实验设空白对照组(hPBMC+PBS),实验组为hPBMC+rBCG。第二部分：应用TLR4功能阻断抗体对hPBMC的TLR4信号通路进行干预,然后用重组人IFN-α-2b-BCG、野生BCG、干扰素和PBS对TLR4信号通路阻断和未阻断的hPBMC进行刺激,并运用ELISA方法比较阻断组和未阻断组TNF-α IL-12、IFN-γ表达量的变化,并利用RT-PCR的方法检测TLR4信号通路中的关键调节因子NFκB、MyD88的变化。实验设空白对照组(hPBMC+PBS),实验组为hPBMC+rBCG; hPBMC+wBCG; hPBMC+hIFN-a-2b。研究结果：第一部分：hIFN-α-2b-BCG对不同浓度hPBMC的作用,在hPBMC浓度小于1.6×106个/ml时,rBCG(终浓度0.010D)并不能增强hPBMC的hTNF-α、 hIL-12、hIFN-γ的表达量,当hPBMC浓度大于1.6x106个/ml时,rBCG(终浓度0.010D)可以有效的上调THl型细胞因子hIFN-γ、hTNF-α、hIL-12的表达,且随着hPBMC细胞浓度的增加,这种促进作用也随之加强。不同浓度的rBCG有效刺激了hPBMC,在刺激24h检测发现hTNF-α、hIL-12、hlFN-γ表达量发生明显变化,且这种变化与rBCG浓度具有明显的剂量效应关系,且各浓度组与空白对照相比均有显著优势(p<0.05)。hIFN-α-2b-BCG调节免疫反应中,不同细胞因子的生成有其最适rBCG刺激浓度,本实验所测的rBCG刺激hPBMC24h后分泌hTNF-α、hIL-12、hIFN-γ的最佳浓度分别为0.02OD、0.04OD和0.00250D。第二部分：重组BCG、野生BCG、干扰素和PBS分别刺激hPBMC后,各组在3h时NFκB、MyD88的RNA表达量显著高于6h和12h,提示NFκB、MyD88的RNA表达峰值出现在6h之前。TLR4抗体阻断后3h, NFκB、MyD88的RNA表达量明显受到抑制,但在6h和12h时,TLR4抗体阻断组和对照组NFκB、MyD88的RNA表达变化无显著差异。刺激3h后NFκB、MyD88的RNA表达量比较：rBCG组>wBCG组>IFN组>PBS组。rBCG组、wBCG组、IFN组与PBS组在6h、12h、48h和72h时,TLR4抗体阻断组较未阻断组,hIFN-y、hTNF-α、hIL-12的表达量明显受到抑制(p<0.05)。rBCG能显著上调hTNF-α,的表达量,作用优于wBCG、IFN-α-2b和空白组(p<0.05)；rBCG对hIFN-γ的上调作用与wBCG无显著差异(p>0.05),但两者均明显优于IFN-α-2b和空白组(均p<0.05)。rBCG、wBCG和IFN均能显著增强hPBMC的NFκB、MyD88的RNA表达,这一增强作用均被TLR4抗体明显抑制,这一变化与hIFN-y、hTNF-α、hIL-12的表达量变化一致。结论：重组人IFN-κ-2b-BCG诱导1iPBMC分泌hTNF-α、hIL-12、hIFN-γ存在剂量-效应作用关系；TLR4信号通路在重组hIFN-α-2b-BCG介导的肿瘤免疫反应中发挥重要作用,本研究结果提示重组BCG通过TLR4-MyD88-NFκB信号通路对hPBMC分泌Th1细胞因子的表达量进行调节。