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血脑屏障(Blood-brain Barrier, BBB)通透性增加在感染性脑损伤的发病中起关键作用。BBB主要由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)及紧密连接(tight junction, TJ)构成,BBB发挥着物理和代谢屏障的功能,保护脆弱的脑组织免受毒物、炎症因子的攻击,提供营养物质、过滤有害物质,降低脑组织对微环境改变的易感性,从而保证脑功能的正常发挥。而BMECs及紧密连接通透性变化是导致BBB屏障功能破坏的主要原因之一。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α、TNF-α)是一种多功能的炎症前细胞因子,我们前期的研究发现,在细菌性脑膜炎动物模型中TNF-α mRNA及蛋白表达量在造模240min达高峰,并与BBB通透性增高成正比；同样利用TNF-α刺激体外BBB模型5hr后,BBB通透性明显增高,应用Rho激酶抑制剂Y-27632可以明显抑制TNF-α引起的脑微血管内皮细胞通透性增高。提示TNF-α可能通过RhoA参与了感染性脑损伤导致的BBB破坏的病理过程,但其具体的调控方式及上游的调控机制不明。因此研究TNF-α对RhoA活化的影响及其具体的调控机制,有助于了解TNF-α引起BBB通透性增高的病理过程。对这一问题的深入探讨,有助于进一步阐明感染性脑水肿脑损伤的发病机制,为其临床防治提供新的思路。本研究分为三部分：第一部分RhoA参与TNF-a致脑微血管内皮细胞通透性增高的调控研究目的证实RhoA参与调控TNF-a诱导的BMECs通透性增高。方法体外培养小鼠BMECs (Bend.3细胞株),分别将PcDNA3.1hygro-n19Rho A (RhoA的负性质粒)和PcDNA3.1hygro-vector(空载对照质粒)导入Bend.3细胞,利用潮霉素B筛选出稳定表达株。Western blot鉴定RhoA蛋白的表达抑制情况；pull-down检测TNF-a作用不同时间后,BMECs的RhoA活化状态变化；直接免疫荧光检测TNF-a作用不同时间后,BMECs的F-actin重组情况；跨膜电阻(Transendothelial electrical resistance,TER)检测抑制RhoA表达对TNF-a刺激后BMECs通透改变的影响。结果成功建立了稳定表达n19RhoA及vector-1的Bend.3细胞株。Pull down证实TNF-α诱导1min后RhoA活化开始增加,30min达到高峰；直接荧光证实TNF-α作用3hr后,F-actin发生重组,12hr后达高峰；TER检测发现TNF-α导致BMECs通透性增高,TER下降,12hr达到高峰,24hr仍不能恢复正常。结论证实RhoA活化参与了TNF-α导致BMECs通透性增高的调控,抑制其活性可降低BMECs通透性。第二部分TNF-α诱导RhoA活化及脑微血管内皮细胞通透性增高的调控机制研究目的了解TNF-α是否通过PKC-α/p115RhoGEF/RhoA信号通路诱导RhoA活化并导致BMECs通透性增高。方法1.将PLKO.1-puro-PKC-α-shRNA、PLKO.1-puro-PKC-β-shRNA、p115RhoGEF-shRNA和empty PLKO.1-puro vector分别导入Bend.3细胞,利用嘌呤霉素B筛选出稳定表达株。Wester blot分别鉴定PKC-α、 PKC-β和p115RhoGEF蛋白的表达抑制情况。2.经典型PKC抑制剂(G66976)预处理后,或稳定表达上述质粒的BMECs给予TNF-α刺激后,Pull down技术检测RhoA活性,观察抑制经典型PKC、PKC-α、PKC-β和p115RhoGEF表达对TNF-α刺激后RhoA活化的影响；32p标记上述各组细胞后,Western blot检测不同时间点TNF-α刺激后p115RhoGEF的磷酸化水平,明确PKC亚型是通过磷酸化p115RhoGEF参与了TNF-α诱导的RhoA活化；稳定表达n19RhoA和p115-shRNA及相应vector的BMECs给予TNF-a刺激后,体外酶学实验检测PKC活化水平,进一步验证PKC是RhoA活化的上游调控信号。3.将稳定表达n19RhoA.PKCa-shRNA、p115-shRNA和vector的Bend.3细胞予TNF-α刺激3hr后,直接免疫荧光观察F-actin的重组情况；TNF-α刺激后0-24hr,TER观察BMECs屏障功能的改变情况。结果1.成功建立稳定表达PKCa-shRNA、PKCβ-shRNA. p115-shRNA及vector-2的Bend.3细胞株。2.实验观察到TNF-α作用Bend.3细胞0.5min后,导致PKC活化和p115RhoGEF磷酸化。经典型PKC抑制剂Go6976预处理后明显抑制了TNF-α导致的p115RhoGEF磷酸化以及RhoA活化,说明经典型PKC参与了TNF-α导致的RhoA活化的调控。利用PKCa-shRNA、PKCp-shRNA稳定转染的细胞株,发现PKC-α而不是PKC-β可以抑制TNF-α导致的RhoA活化。体外酶学实验进一步证实,抑制p115RhoGEF和RhoA的表达,对PKC-α的活化没有影响。3.抑制PKC-α、p115RhoGEF的表达可以减轻TNF-α导致的BMECs的F-actin重组及TER下降。结论以上证据提示,PKC-α而不是PKC-β是p115RhoGEF磷酸化和RhoA活化的上游调控信号。PKC-α/p115RhoGEF/RhoA信号通路参与调控TNF-α导致的BMECs的F-actin重组及屏障功能破坏。第三部分大鼠大肠杆菌脑膜炎时BBB通透性增加的机制研究目的探讨大鼠大肠杆菌脑膜炎时BBB通透性增加的可能机制,了解PKC-α, p115RhoGEF和RhoA信号通路是否与大肠杆菌脑膜炎大鼠BBB通透性增加相关。方法大鼠小脑延髓池注射大肠杆菌建立大肠杆菌脑膜炎模型,并予行为学评分、脑脊液细菌培养、H.E.和尼氏染色法鉴定。实验分脑膜炎模型组和生理盐水对照组。各组大鼠脑组织行伊文思兰半定量检测鉴定其BBB通透性改变；RT-PCR了解TNF-α表达变化；pull-down和体外酶学实验分别检测RhoA和PKC-α活化状态变化；Western blot测定p115RhoGEF蛋白表达改变。结果成功建立大鼠大肠杆菌脑膜炎模型。伊文思兰半定量检测显示大肠杆菌脑膜炎大鼠BBB通透性增加,RT-PCR证实大肠杆菌脑膜炎大鼠脑组织中TNF-α表达上升,且TNF-α表达水平的增加与PKC-α和RhoA活化,p115RhoGEF表达上调相关。结论大肠杆菌脑膜炎时大鼠BBB通透性增加,PKC-α, p115RhoGEF和RhoA信号通路与其关系密切。