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Harpin蛋白是在病原菌—植物相互作用过程中,由革兰氏阴性细菌的过敏反应和致病性基因hrp（hypersensitive response and pathogenicity,hrp）编码的既能诱导非寄主植物产生过敏性反应（hypersensitive response,HR）,又对寄主植物具有致病性的一类蛋白。目前,关于harpin蛋白在病原菌与植物互作过程中详细的作用机制尚不明确,现有报道中harpin蛋白可以由Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）分泌,但是在前期工作中来自病原菌Xanthomonas citri subsp.malvacearum（Xm）的hpaXm的N端前15个氨基酸（LP）为类似信号肽,猜测hpaXm可能由除T3SS以外的分泌系统进行分泌。因此本论文分为两大部分,第一部分是研究LP对hpaXm的分泌、定位、互作、激发HR、诱导抗病、促进植物生长以及耐热能力的影响;第二部分是在病原菌与植物相互作用过程中,研究hpaXm从病原菌细胞到植物细胞被运输的整个过程。获得的主要研究结果如下:1.为了探索LP对hpaXm分泌的影响,我们利用基于酵母细胞对转化酶需求的方法,证实了 LP不具有分泌能力,LP缺失后的hpaXm依然具有分泌能力。另外对hpaXm以报道的功能片段进行分泌能力的验证,结果显示hpaXm16-59能够分泌,hpaXm60-133不能够分泌,表明影响hpaXm分泌的片段可能位于第16位至第59位氨基酸之间;我们还通过比较hpaXm与hpaXmΔLP两者之间关于分泌到菌体胞外的差异,将Xm与ΔLP分别侵染棉花叶片,发现缺失LP的hpaXm（hpaXmΔLP）依然能够从Xm中分泌到胞外并进入到棉花细胞中。通过分别对各处理后棉花单个细胞中胶体金颗粒个数的统计分析,发现Xm显著（P<0.05）大于ΔLP。表明虽然LP缺失后的hpaXm能够分泌,但LP的缺失降低了 hpaXm的分泌能力。通过比较hpaXm与hpaXmΔLP两者之间关于在宿主细胞中定位的差异,利用农杆菌介导的瞬时表达技术,发现hpaXm在缺失LP时依然能够定位于棉花细胞的细胞核、细胞质与叶绿体;利用免疫胶体金技术,检测ALP侵染棉花后胶体金颗粒在棉花细胞中的定位,发现hpaXm在缺失LP时能够定位细胞核、细胞质、叶绿体和线粒体,但无法定位于细胞壁。表明LP决定了在细胞壁上的定位。利用Pull-down技术、质谱鉴定技术与酵母双杂交技术,筛选到6个hpaXm的互作蛋白,分别为m3（KJB79067.1,果糖-1,6-二磷酸醛缩酶fructose-1,6-bisphosphate aldolase,FBA）、m5（KHG27361.1,植物醛酮还原酶 putative aldo-keto reductase 1）、m25（ABC73623.1,光系统 Ⅱ photosystem Ⅱ protein D2）、m27（AGU09699.1,丙二烯氧化物环化酶 allene oxide cyclase）、m29（KHG25151.1,通用应激蛋白 universal stress protein）与 m33（KHG04311.1,核糖体 60S 大亚基 60S ribosomal L4）。利用酵母双杂交技术,对hpaXmΔLP与以上6个蛋白进行相互作用关系验证,结果显示hpaXmΔLP与以上6个蛋白均能够互作。表明LP不影响hpaXm与以上6个蛋白的相互作用关系。通过比较hpaXm与hpaXmΔLP两者之间关于激发HR、诱导防卫反应以及促进植物生长的能力差异,发现hpaXm与hpaXmΔLP激发HR与诱导防卫反应能力相当,但显著（P<0.05）降低了 hpaXm促进植物生长的能力。表明LP不影响hpaXm激发HR能力与诱导防卫反应的能力,但降低了 hpaXm促进植物生长的能力。通过比较经不同高温处理后hpaXm与hpaXmΔLP两者之间激发烟草HR的能力发现,LP对hpaXm的耐热能力没有影响。2.利用同源重组的原理,通过敲除Xm中hrcV基因获得T3SS缺失突变体（ΔT3SS）,敲除Xm中xpsL基因获得T2SS缺失突变体（ΔT2SS）。利用免疫胶体金技术,将Xm、ΔT2SS、ΔT3SS分别侵染棉花叶片,发现在经各菌体侵染后的棉花细胞中均有胶体金颗粒的存在,表明hpaXm在T2SS或T3SS缺失后依然能够从Xm中分泌到胞外并进入到棉花细胞中。表明除T3SS外,hpaXm还存在其他的分泌方式。通过分别对各个处理后的棉花单个细胞中胶体金颗粒个数的统计分析,发现Xm显著（P<0.05）大于ΔT3SS或ΔT2SS。也就是说不论T3SS还是T2SS的缺失都对hpaXm的分泌是有影响的。表明hpaXm的分泌方式不仅存在T3SS,hpaXm可能还存在T2SS及其他方式泌出胞外。4.检测各突变体侵染棉花后hpaXm定位时,发现hpaXm能够定位于棉花细胞的囊泡上,这暗示着hpaXm进入棉花细胞的方式之一可能为植物的内吞作用。通过监测荧光标记的hpaXm从胞外被内吞进入模式植物烟草的悬浮细胞的整个过程,发现了 hpaXm能够按照严格的时间与能量的依赖方式被内吞进入烟草细胞,结合hpaXm在囊泡中的定位,证实了 hpaXm能够被内吞进入烟草细胞。5.为了探究T3SS、T2SS和hpaXm对Xm代谢的影响,采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）技术检测了 ΔT3SS、ΔT2SS与缺失hpaXm基因的Xm突变体（Δhpa）三个突变菌株分别与Xm之间的差异代谢物。对差异代谢物的KEGG富集分析结果显示,与Xm相比较,ΔT3SS、ΔT2SS与Δhpa中的差异代谢物,均在ABC转运蛋白通路上显著（P<0.01）富集,并且ΔT3SS、ΔT2SS与Δhpa中的差异代谢物在多个代谢通路上显著（P<0.05）富集,说明hpaXm与分泌途径T2SS和T3SS有着密切的联系。本研究为探究harpin蛋白的作用机制奠定基础,对理解植物病原细菌致病机理及植物与病原物的互作机制具有重要意义。