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研究背景及目的急慢性创面、尤其是严重烧(创)伤后皮肤缺损形成的大面积创面,易导致休克、感染、脏器功能损害等并发症,甚至危及患者生命,如何尽早修复创面一直是烧(创)伤临床救治中最棘手和急迫的问题。利用自体少量皮源快速修复创面是患者抢救成功的关键。组织工程皮肤和细胞治疗学为此带来新的希望,而种子细胞是组织工程皮肤至关重要的组成部分。具有排斥反应的异体和异种细胞移植后只能临时存活,自体和无排斥反应的异体细胞成为理想种子细胞和治疗用细胞的最佳选择。人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)取材于脐带华通胶(Wharton’s Jelly,WJ)组织,与骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)等相比,具有更强自我增殖、多向分化和促进效应细胞增殖等功能,并能在体外维持更长时间;而且来源广泛、非侵入性取材、不受伦理限制、病毒感染概率低;具有免疫调节作用的同时还能避免细胞毒性T细胞和NK细胞的免疫杀伤,在不使用免疫抑制剂的情况下,异体hUC-MSCs移植后几乎不会引起免疫排斥反应;移植后不具有致瘤性。因此,hUC-MSCs正成为充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的主要来源、作为治疗细胞应用于创面修复和作为种子细胞应用于组织工程皮肤的构建等研究中。但目前技术条件下诱导hUC-MSCs向角质形成细胞(Keratinocytes,KCs)等分化率仍较低,单独应用于创面促进其上皮化时间较长。如将hUC-MSCs与KCs联合应用,则可能在保存hUC-MSCs特性基础上,快速提供创面上皮化所需的KCs。KCs是皮肤屏障表皮主要构成细胞,其数量约占表皮细胞的80%以上,能够连续不断地分化与更新,使新生细胞与脱落的角质层细胞保持平衡,在分化过程中产生角蛋白。有研究证实患者自体KCs悬液可加速烧伤创面和部分慢性创面的愈合;KCs也是组织工程皮肤中不可或缺的种子细胞,异体来源KCs只能暂时存活,目前多主张采用自体KCs。而成人表皮中的KCs已有一定程度的分化,其分裂扩增能力低且寿命短,且常规体外培养条件下生长缓慢、生命周期短、易分化和衰老等不利于其临床应用。而有研究证实hUC-MSCs可抑制KCs凋亡、促进其增殖和迁移等,联合应用可能改善成人原代KCs上述不足。为探讨hUC-MSCs和KCs联合应用是否更优于单独应用作为种子细胞参与组织工程皮肤的构建和作为效应细胞参与促创面愈合的细胞治疗,开展本研究。通过分离培养人hUC-MSCs和人KCs,将两者间接或直接共培养,了解hUC-MSCs对共培养体系中KCs增殖的影响及相关机制,从而为hUC-MSCs与患者自体KCs联合应用作为种子细胞参与构建组织工程皮肤和作为效应细胞参与促创面愈合的细胞治疗提供理论依据。方法1、采用酶消化法从健康足月产新生儿脐带中分离培养hUC-MSCs。显微镜下观察hUC-MSCs形态特点;采用MTT法检测不同代hUC-MSCs增殖能力并绘制生长曲线;流式细胞术鉴定其细胞表面标志物;成软骨实验检测hUC-MSCs的多向分化潜能。2、采用两步消化法,从成人皮肤分离培养原代KCs。显微镜下进行形态学观察;免疫荧光染色检测KCs细胞标志物CK19,β1-整合素表达。3、将P3代hUC-MSCs与P3代KCs按照细胞数比例为1:1、1:2、2:1分组建立直接共培养体系,设立单纯hUC-MSCs和单纯KCs培养组作为对照组。用MTT法检测两种共培养后24h、48h、72h各组细胞OD值,免疫荧光染色检测KCs细胞标志物CK19、β1-整合素表达,ELISA法检测共培养上清液中表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的含量。4、取P3代hUC-MSCs 1×105个接种在Transwell上室,将P3代KCs 2×105个接种于Transwell下室,建立间接共培养体系;对照组为Transwell下层接种KCs,Transwell上室为培养液。采用MTT法检测细胞共培养后24h、48h、72h各组细胞OD值,ELISA法检测共培养上清液中EGF、VEGF的含量。结果1、采用酶消化法从健康足月产新生儿脐带分离培养的细胞在显微镜下观察呈现长梭形或多角形,细胞整体呈“旋涡状”生长;流式细胞术检测发现分离培养的细胞高表达 CD105(98.3±0.9)%和 CD90(97.1±1.5)%,低表达 CD34(1.1±0.2)%和HLA-DR(0.7±0.5)%;MTT法检测hUC-MSCs增殖并绘制生长曲线发现各代细胞接种后1d内为潜伏期,然后进入对数增殖期,第7d达到峰值;通过成软骨诱导,诱导后21d免疫荧光染色检测到细胞有Ⅱ型胶原的表达。2、采用两步酶消化法从成人皮肤中分离培养的KCs多数呈圆形,形态较规则,细胞培养后6d后开始汇合连接成片,呈铺路石样紧密排列;免疫荧光染色显示培养的细胞CK19、β1-整合素表达为阳性。3、将hUC-MSCs与KCs按不同比例直接共培养,显微镜下观察两种细胞可以共培养增殖。MTT法检测结果显示hUC-MSCs与KCs细胞数比1:2组其OD值最高,且共培养3组OD值均明显高于单纯hUC-MSCs和单纯KCs培养组(P<0.05);免疫荧光染色显示共培养组细胞数较单纯KCs培养组明显增多;共培养组的CK19、β1-整合素的免疫荧光表达也较KCs单纯培养组增强;共培养3组中培养上清液中EGF、VEGF含量均显著高于单纯hUCMSCs组及单纯KCs组(P<0.05),其中,以细胞数比1:2组培养上清液中EGF、VEGF的含量最高。4、MTT法检测结果显示hUC-MSCs与KCs间接共培养组于共培养后24h、48h、72h时OD值均高于单纯KCs培养组,间接共培养后72h共培养组OD值与单纯KCs培养组有明显差异(P<0.05);ELISA检测结果显示hUC-MSCs与KCs间接共培养组培养上清液中的EGF、VEGF含量明显高于单纯KCs培养组(P<0.05)结论1、本研究在体外成功分离培养出hUC-MSC和人KCs,并予鉴定,为hUC-MSCs与人KCs研究应用提供技术支持。2、hUC-MSCs能促进hUC-MSCs与KCs直接或间接共培养体系中KCs细胞增殖。提示hUC-MSCs和KCs可联合应用作为种子细胞参与组织工程皮肤的构建和促进创面愈合的细胞治疗。3、hUC-MSCs促进直接或间接共培养体系中KCs细胞增殖,可能与其分泌EGF、VEGF等旁分泌功能有关。