干旱导致我国荒漠化和沙化土地总面积占国土面积的近45%。柠条作为防风固沙的优势物种,近年来从生态价值、生理特征及形态解剖等方面进行的抗旱机制研究较多,而在分子水平的机制阐释较少,从miRNA调控入手对干旱响应的解释更少。本研究应用高通量测序技术对自然降水梯度下的三个柠条分布区的柠条叶样进行miRNA测序,预测与柠条抗旱相关的miRNAs,结合miRNA调控的靶基因对柠条的干旱适应机制进行研究。同时为排除其他非生物胁迫的干扰,我们设计室内单因素控水实验,将柠条分别置于土壤相对含水量为75%,55%和35%三个不同的水分梯度下模拟野外干旱胁迫。通过检测野外样品和室内控水实验样品中与干旱响应有关的miRNA和靶基因的表达,为阐明柠条抗旱的分子机制扩充有关miRNAs调控靶基因响应干旱机理的内容。论文主要结果如下:(1)野外选取黄土高原降水依次减少的三个试验点(黄陵、榆林和达拉特旗)柠条叶片进行mi RNA转录组测序。三个样品分别获得了13,710,681,15,048,945和15,198,442条reads。共鉴定获得490个已报道的miRNAs,预测96个未报道的新miRNAs。(2)对已鉴定和预测的586个miRNA进行GO功能富集分析和KEGG通路显著性富集分析,获得39个可能与水分胁迫应答相关的miRNA。利用stem loop qPCR分析验证了miRNA高通量测序预测的9个差异表达miRNAs(miR390,miR394,miR398,miR529,miR530,miR2119,miR5232,miR5559,miR5770),结果表明9个miRNAs的差异表达趋势与测序预测数据一致。(3)对响应干旱较为关键的5个miRNA(miR390,miR398,miR530,miR2119,miR5559),室内设计三个水分梯度(75%,55%,35%)模拟野外干旱胁迫进行验证。利用qPCR同时对野外和室内柠条样品mi RNA表达进行定量分析,结果表明这5个miRNA对自然干旱和室内干旱梯度具有相同的响应趋势,即随干旱加剧柠条miRNA表达量均呈下调趋势。(4)进而对其中2个鲜有报道的miRNA(miR2119和miR5559)预测的靶基因进行定量分析,野外和室内结果表明随水分胁迫的加剧这2个miRNAs的表达量降低,而各自2个靶基因却呈现上调趋势。相关性分析表明:miR2119与靶基因BI-1和CAP的表达趋势相关性R2达到了0.942和0.852;miR5559与靶基因HIRA和SEO的表达趋势相关性R2分别达到了0.960和0.966。(5)进一步克隆miR2119和靶基因BI-1和CAP。构建pCMBIA-1304-amiR2119、pCMBIA-1304-BI-1和pCMBIA-1304-CAP载体,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时转染法证实miR2119与靶基因BI-1和CAP存在互作。利用农杆菌介导的烟草遗传转化法,获得转miR2119、BI-1和CAP基因的烟草转基因系。综合上述实验结果得出结论:我们证实高通量测序预测的可能对水分胁迫存在应答的39个柠条miRNA中的5个均对干旱有响应;进而确定其中一个鲜有报道的mi R2119是通过负调控其靶基因BI-1和CAP的上调表达响应干旱的加剧。从而提出柠条通过miRNA调控与干旱响应相关的靶基因实现对干旱环境的适应。