肿瘤坏死因子及其受体超家族在淋巴器官的发生、自身免疫性疾病、抗病毒免疫等中均发挥重要的作用。为了获得高表达、高活性的BAFF和TNFRSF13B2-Fc蛋白,我们构建了原核表达系统,在较低的成本下,得到高纯度蛋白,为以后的疾病药物的开发提供支持。第一部分罗非鱼BAFF的相关研究B淋巴细胞刺激因子(BAFF)是TNF超家族的重要成员。BAFF广泛参与B淋巴细胞的生长、发育和分化,在炎症,免疫反应和组织稳态的调节中发挥关键作用。本实验,从尼罗罗非鱼的脾脏扩增到B淋巴刺激因子(tBAFF)的mRNA,逆转录(RT-PCR)为全长cDNA序列。与其它物种已知BAFF特征相同,tBAFF的氨基酸序列(261个氨基酸)含有一个预测跨膜结构域、潜在的弗林酶切位点(R-R-R-R)、一个典型的TNF结构域。实时定量PCR(Real-TimePCR)结果表明,tBAFF在各种组织中均能表达,但主要表达在脾脏淋巴组织中。重组pET28a-tsBAFF载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,通过镍柱纯化得到的融合蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot印迹和Mass spectrometry分析鉴定蛋白纯度。体外WST-8和流式细胞分析表明,tsBAFF蛋白能够促进小鼠脾脏B淋巴细胞的存活。激光共聚焦也显示该蛋白可以与小鼠B淋巴细胞表面的受体结合。我们推测,tsBAFF可能是提高罗非鱼免疫功效潜在的免疫因子。第二部分人TNFRSF13B2-Fc的相关研究TNFRSF13B是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRF)的重要成员。在体内外,TNFRSF13B被认为是BAFF信号的一个负向调节受体,对调节B细胞数量的动态平衡起关键作用。TNFRSF13B胞外含两个CRD,N端的两个CRD可被选择性的剪切掉一个然后拼接成另一种形式,但是与配体结合、诱导细胞信号的能力没有丧失。本实验从人外周血中提取mRNA,通过RT-PCR扩增得到TNFRSF13B的cDNA,然后设计引物扩增出只含有一个CRD结构的胞外功能区hsTNFRSF13B2,并构建原核可溶表达载体pET28a-hsTNFRSF13B2-Fc。优化诱导表达条件,通过Protein A 一步纯化得到可溶hsTNFRSF13B2-Fc蛋白,并对其进行 SDS-PAGE 和 Western Blot 印迹鉴定。ELISA 显示在体外,hsTNFRSF13B2-Fc可以和配体BAFF蛋白结合,并呈现剂量依赖性。