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背景：
心肌梗死(myocardial infarction, MI)是因冠状动脉或其分支阻塞而引起的心肌细胞的能量供应不足及利用障碍导致心肌细胞坏死、纤维化，进而导致心肌细胞、胞外基质、胶原纤维网均发生相应变化，即心室重构，并可逐步进展为心力衰竭(heart failure, HF)，严重威胁人类的健康和生命。如何延缓、逆转心室重构，是MI临床治疗的关键。心脏纤维化和心肌细胞凋亡是MI后心室重构的重要机制。
心脏纤维化的主要表现为心脏成纤维细胞(Cardiacfibroblasts, CFs)数目增多、胶原合成增加而降解减少，导致心肌细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)胶原过度沉积，Ⅰ、Ⅲ型胶原不成比例地增多与排列紊乱。维持胶原合成和降解平衡对改善MI后心室重构具有重要意义。CFs在生理性和病理性因素刺激下通过平衡ECM的合成和降解维持心脏稳态，CFs也可以转分化为心脏肌成纤维细胞(cardiac myofibroblasts, CMFs)，CMFs通过增加胶原降解、调节自分泌/旁分泌因子和用纤维瘢痕组织取代心肌细胞而导致心脏结构和功能改变，以α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)表达增多和ECM产生增多为该过程特征，其中包括ECM成分纤维连接蛋白(fibronectin)ED-A片段表达增多。因此调节CFs转分化过程为改善MI后心脏纤维化提供了新靶点。
心肌细胞凋亡在MI后心室重构过程中发挥重要作用。心肌细胞凋亡使细胞之间的紧密连接遭到破坏，容易导致心肌梗死部位室壁薄弱、心室扩大，进而导致心室舒张末期压力不断增高，心肌细胞持续凋亡，形成凋亡-重构恶性循环。MI后心肌缺氧、缺血导致许多炎性趋化因子从细胞内释放，促使巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞等炎性细胞转移至心肌梗死区，激活Caspase级联反应，调控心肌细胞凋亡，参与心室重构的发生发展。因此研究心肌梗死后糜蛋白酶对心肌细胞凋亡的调节机制有助于进一步为心室重构的治疗提供新思路和方向。
糜蛋白酶是一种分子量为29kD的丝氨酸蛋白酶，具有胰凝乳蛋白酶样活性，是心脏肥大细胞颗粒的主要成分之一。小鼠糜蛋白酶包括小鼠肥大细胞蛋白酶(mMCP)-1，-4，-5和-9。当肥大细胞受到损伤或炎症等刺激时，会脱颗粒释放激活的糜蛋白酶。mMCP4是小鼠结缔组织中起主导作用的糜蛋白酶。因此，mMCP4可能在心室重构过程中与人类糜蛋白酶最具同源性。目前国内外尚无文献报道发现糜蛋白酶是如何通过TGF-β1/Smad通路影响CFs转分化以及如何参与调节心肌细胞凋亡参与MI后心脏重构。因此本研究旨在深入探讨该作用机制，探讨糜蛋白酶如何通过TGF-β1/Smad通路调节CFs转分化以及如何参与调节心肌细胞凋亡进而在MI后心室重构中发挥重要作用。
第一部分探究缺乏mMCP4对小鼠心梗后心功能的影响
目的：
通过mMCP4基因敲除小鼠和野生型(wild type, WT)小鼠分别构建心肌梗死模型，观察缺乏mMCP4对小鼠心肌梗死后心功能的影响。
方法：
1.Genotyping鉴定mMCP4基因敲除小鼠。
2.免疫印迹法检测Mcpt4–/–小鼠与WT小鼠心脏组织中mMCP4表达。
3.通过永久性结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心肌梗死模型，假手术组(Sham)仅穿线不结扎。观察不同基因型小鼠的心肌梗死面积、心功能和存活率。
结果：
1.验证mMCP4在Mcpt4–/–小鼠中成功敲除，心脏组织中不表达mMCP4。
2.通过构建小鼠心肌梗死模型，Mcpt4–/–小鼠在心肌梗死28天后具有较小的心肌梗死面积，较好的心功能，然而与WT小鼠相比死亡率并没有显著差异。
结论：
小鼠心肌梗死后，缺乏mMCP4可以导致心肌梗死面积减小并伴随心功能的改善。
第二部分体内实验验证mMCP4在MI后心室重构中的作用
目的：
在构建小鼠心肌梗死模型的基础上，观察mMCP4在心肌梗死后心室重构中的作用。
方法：
1.免疫印迹法检测mMCP4、TGF-β1/Smad通路和组织蛋白酶(Cathepsin， Cat)在心肌梗死组织中的表达水平。
2.明胶酶谱法检测MMP-2/9在心肌梗死组织中的活性。
3.免疫组化方法检测心梗区域免疫细胞和TGF-β1/Smad通路的变化。
4.Tunel染色和免疫荧光染色检测心肌组织中心肌细胞和CFs的凋亡情况以及mMCP4在心肌组织多种细胞内的表达。
5.RT-PCR检测心肌梗死后炎性细胞、心脏纤维化和心功能相关指标。
结果：
1.免疫印迹结果显示，mMCP4在WTMI组中表达较WTSham组显著增高。Smad2/3与CathepsinK/S在WTMI组中表达显著高于较Mcpt4–/–MI组。
2.明胶酶谱法显示MMP-2/9在Mcpt4–/–MI组活性显著降低。
3.免疫组化结果显示Mcpt4–/–MI组在心梗区域巨噬细胞减少、T细胞增多，以及在心梗区域减少TGF-β1,p-Smad2和p-Smad3的表达，但是并没有减少胶原和α-SMA表达。
4.Tunel染色结果显示Mcpt4–/–MI组具有较少的细胞凋亡。免疫荧光染色结果显示在心肌梗死区域Mcpt4–/–MI组心肌细胞凋亡显著降低，在心肌梗死区mMCP4多在心肌细胞内表达。
5.RT-PCR结果验证Mcpt4–/–MI组中Gata-3阳性Th2细胞表达增高和MMP-2表达降低。
结论：
mMCP4可能通过TGF-β1/Smad通路影响CFs转分化，也在心肌细胞内表达进而参与心肌细胞凋亡的调控，从而在MI后心室重构中发挥作用。
第三部分细胞水平验证mMCP4对CFs和心肌细胞的影响及分子机制
目的：
观察mMCP4对小鼠心脏CFs转分化的作用以及对心肌细胞凋亡的影响。
方法：
1.体外培养CFs，使用免疫印迹法检测mMCP4对小鼠CFs转分化作用。
2.体外培养巨噬细胞和T细胞，使用免疫印迹法检测Cathepsin在不同细胞中的表达，明胶酶谱法检测MMP-2/9在不同细胞中的活性。
3.体外培养成年小鼠心肌细胞，使用流式细胞技术和免疫荧光染色检测mMCP4对心肌细胞凋亡的影响，使用免疫印迹法检测mMCP4在心肌细胞凋亡过程中的分子机制。
结果：
1.体外培养Mcpt4–/–和WT小鼠CFs，使用TGF-β诱导CFs转分化，免疫印迹法结果显示，来自Mcpt4–/–小鼠的CFs显示出与WT小鼠的CFs相当水平的p-Smad2和p-Smad3。
2.巨噬细胞和T细胞的明胶酶谱法和免疫印迹结果显示mMCP4敲除后细胞MMP-2,MMP-9活性降低以及CathepsinsS/K表达降低。
3.流式细胞术，免疫印迹分析和免疫荧光染色证明mMCP4缺乏可以降低心肌细胞中促凋亡组织蛋白酶的表达，并保护心肌细胞免受H2O2诱导的细胞凋亡。
结论：
mMCP4通过调节心肌细胞组织蛋白酶表达和心肌细胞凋亡在小鼠MI后功能障碍中发挥作用。
心肌梗死(myocardial infarction, MI)是因冠状动脉或其分支阻塞而引起的心肌细胞的能量供应不足及利用障碍导致心肌细胞坏死、纤维化，进而导致心肌细胞、胞外基质、胶原纤维网均发生相应变化，即心室重构，并可逐步进展为心力衰竭(heart failure, HF)，严重威胁人类的健康和生命。如何延缓、逆转心室重构，是MI临床治疗的关键。心脏纤维化和心肌细胞凋亡是MI后心室重构的重要机制。
心脏纤维化的主要表现为心脏成纤维细胞(Cardiacfibroblasts, CFs)数目增多、胶原合成增加而降解减少，导致心肌细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)胶原过度沉积，Ⅰ、Ⅲ型胶原不成比例地增多与排列紊乱。维持胶原合成和降解平衡对改善MI后心室重构具有重要意义。CFs在生理性和病理性因素刺激下通过平衡ECM的合成和降解维持心脏稳态，CFs也可以转分化为心脏肌成纤维细胞(cardiac myofibroblasts, CMFs)，CMFs通过增加胶原降解、调节自分泌/旁分泌因子和用纤维瘢痕组织取代心肌细胞而导致心脏结构和功能改变，以α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)表达增多和ECM产生增多为该过程特征，其中包括ECM成分纤维连接蛋白(fibronectin)ED-A片段表达增多。因此调节CFs转分化过程为改善MI后心脏纤维化提供了新靶点。
心肌细胞凋亡在MI后心室重构过程中发挥重要作用。心肌细胞凋亡使细胞之间的紧密连接遭到破坏，容易导致心肌梗死部位室壁薄弱、心室扩大，进而导致心室舒张末期压力不断增高，心肌细胞持续凋亡，形成凋亡-重构恶性循环。MI后心肌缺氧、缺血导致许多炎性趋化因子从细胞内释放，促使巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、中性粒细胞等炎性细胞转移至心肌梗死区，激活Caspase级联反应，调控心肌细胞凋亡，参与心室重构的发生发展。因此研究心肌梗死后糜蛋白酶对心肌细胞凋亡的调节机制有助于进一步为心室重构的治疗提供新思路和方向。
糜蛋白酶是一种分子量为29kD的丝氨酸蛋白酶，具有胰凝乳蛋白酶样活性，是心脏肥大细胞颗粒的主要成分之一。小鼠糜蛋白酶包括小鼠肥大细胞蛋白酶(mMCP)-1，-4，-5和-9。当肥大细胞受到损伤或炎症等刺激时，会脱颗粒释放激活的糜蛋白酶。mMCP4是小鼠结缔组织中起主导作用的糜蛋白酶。因此，mMCP4可能在心室重构过程中与人类糜蛋白酶最具同源性。目前国内外尚无文献报道发现糜蛋白酶是如何通过TGF-β1/Smad通路影响CFs转分化以及如何参与调节心肌细胞凋亡参与MI后心脏重构。因此本研究旨在深入探讨该作用机制，探讨糜蛋白酶如何通过TGF-β1/Smad通路调节CFs转分化以及如何参与调节心肌细胞凋亡进而在MI后心室重构中发挥重要作用。
第一部分探究缺乏mMCP4对小鼠心梗后心功能的影响
目的：
通过mMCP4基因敲除小鼠和野生型(wild type, WT)小鼠分别构建心肌梗死模型，观察缺乏mMCP4对小鼠心肌梗死后心功能的影响。
方法：
1.Genotyping鉴定mMCP4基因敲除小鼠。
2.免疫印迹法检测Mcpt4–/–小鼠与WT小鼠心脏组织中mMCP4表达。
3.通过永久性结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心肌梗死模型，假手术组(Sham)仅穿线不结扎。观察不同基因型小鼠的心肌梗死面积、心功能和存活率。
结果：
1.验证mMCP4在Mcpt4–/–小鼠中成功敲除，心脏组织中不表达mMCP4。
2.通过构建小鼠心肌梗死模型，Mcpt4–/–小鼠在心肌梗死28天后具有较小的心肌梗死面积，较好的心功能，然而与WT小鼠相比死亡率并没有显著差异。
结论：
小鼠心肌梗死后，缺乏mMCP4可以导致心肌梗死面积减小并伴随心功能的改善。
第二部分体内实验验证mMCP4在MI后心室重构中的作用
目的：
在构建小鼠心肌梗死模型的基础上，观察mMCP4在心肌梗死后心室重构中的作用。
方法：
1.免疫印迹法检测mMCP4、TGF-β1/Smad通路和组织蛋白酶(Cathepsin， Cat)在心肌梗死组织中的表达水平。
2.明胶酶谱法检测MMP-2/9在心肌梗死组织中的活性。
3.免疫组化方法检测心梗区域免疫细胞和TGF-β1/Smad通路的变化。
4.Tunel染色和免疫荧光染色检测心肌组织中心肌细胞和CFs的凋亡情况以及mMCP4在心肌组织多种细胞内的表达。
5.RT-PCR检测心肌梗死后炎性细胞、心脏纤维化和心功能相关指标。
结果：
1.免疫印迹结果显示，mMCP4在WTMI组中表达较WTSham组显著增高。Smad2/3与CathepsinK/S在WTMI组中表达显著高于较Mcpt4–/–MI组。
2.明胶酶谱法显示MMP-2/9在Mcpt4–/–MI组活性显著降低。
3.免疫组化结果显示Mcpt4–/–MI组在心梗区域巨噬细胞减少、T细胞增多，以及在心梗区域减少TGF-β1,p-Smad2和p-Smad3的表达，但是并没有减少胶原和α-SMA表达。
4.Tunel染色结果显示Mcpt4–/–MI组具有较少的细胞凋亡。免疫荧光染色结果显示在心肌梗死区域Mcpt4–/–MI组心肌细胞凋亡显著降低，在心肌梗死区mMCP4多在心肌细胞内表达。
5.RT-PCR结果验证Mcpt4–/–MI组中Gata-3阳性Th2细胞表达增高和MMP-2表达降低。
结论：
mMCP4可能通过TGF-β1/Smad通路影响CFs转分化，也在心肌细胞内表达进而参与心肌细胞凋亡的调控，从而在MI后心室重构中发挥作用。
第三部分细胞水平验证mMCP4对CFs和心肌细胞的影响及分子机制
目的：
观察mMCP4对小鼠心脏CFs转分化的作用以及对心肌细胞凋亡的影响。
方法：
1.体外培养CFs，使用免疫印迹法检测mMCP4对小鼠CFs转分化作用。
2.体外培养巨噬细胞和T细胞，使用免疫印迹法检测Cathepsin在不同细胞中的表达，明胶酶谱法检测MMP-2/9在不同细胞中的活性。
3.体外培养成年小鼠心肌细胞，使用流式细胞技术和免疫荧光染色检测mMCP4对心肌细胞凋亡的影响，使用免疫印迹法检测mMCP4在心肌细胞凋亡过程中的分子机制。
结果：
1.体外培养Mcpt4–/–和WT小鼠CFs，使用TGF-β诱导CFs转分化，免疫印迹法结果显示，来自Mcpt4–/–小鼠的CFs显示出与WT小鼠的CFs相当水平的p-Smad2和p-Smad3。
2.巨噬细胞和T细胞的明胶酶谱法和免疫印迹结果显示mMCP4敲除后细胞MMP-2,MMP-9活性降低以及CathepsinsS/K表达降低。
3.流式细胞术，免疫印迹分析和免疫荧光染色证明mMCP4缺乏可以降低心肌细胞中促凋亡组织蛋白酶的表达，并保护心肌细胞免受H2O2诱导的细胞凋亡。
结论：
mMCP4通过调节心肌细胞组织蛋白酶表达和心肌细胞凋亡在小鼠MI后功能障碍中发挥作用。