【摘 要】
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目的:构建外泌体AAV基因载体递送核定位信号（NLS）修饰的核结合因子（CBFβ）,探讨其诱导关节液来源间充质干细胞（SF-MSCs）成软骨细胞分化的效应,旨在为外泌体AAV递送核结合因子诱导SFMSCs治疗骨关节炎提供一种新的思路。方法:通过分子生物学方法,构建p AAV-NLS-CBFβ-RFP和p AAVCBFβ-RFP表达质粒;采用PEI转染法分别将p AAV-NLS-CBFβ-RFP/p
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目的:构建外泌体AAV基因载体递送核定位信号（NLS）修饰的核结合因子（CBFβ）,探讨其诱导关节液来源间充质干细胞（SF-MSCs）成软骨细胞分化的效应,旨在为外泌体AAV递送核结合因子诱导SFMSCs治疗骨关节炎提供一种新的思路。方法:通过分子生物学方法,构建p AAV-NLS-CBFβ-RFP和p AAVCBFβ-RFP表达质粒;采用PEI转染法分别将p AAV-NLS-CBFβ-RFP/p AAV-CBFβ-RFP表达质粒和p AAV-RC、p AAV-Helper质粒共转染至AAV-293细胞中,包装并生产携带NLS的CBFβ以及CBFβ的重组腺相关病毒r AAV-NLS-CBFβ-RFP和r AAV-CBFβ-RFP;收集包装后的AAV-293细胞与培养基上清,提纯病毒,以及超高速差速离心法提取包含r AAV-NLS-CBFβ-RFP和r AAV-CBFβ-RFP的外泌体（Exosomes）;将收集的病毒、外泌体进一步转染SF-MSCs。通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察荧光染色观察转染后SF-MSCs荧光情况,通过q RT-PCR检测SF-MSCs的CBFβ基因表达情况,通过Western Blot检测SF-MSCs的CBFβ、Collagen II以及Aggrecan的蛋白表达情况。结果:双酶切琼脂糖凝胶电泳及DNA测序结果提示NLS-CBFβ、CBFβ已成功构建到表达质粒p AAV-NLS-CBFβ-RFP、p AAV-CBFβ-RFP中;质粒转染AAV-293细胞后,倒置显微镜下观察到AAV-293细胞表达红色荧光蛋白,结果提示病毒包装成功。病毒感染SF-MSCs后,通过激光共聚焦显微镜,观察到NLSCBFβ组和CBFβ组的SF-MSCs表达红色荧光,而空白组未见红色荧光;与CBFβ组相比,NLS-CBFβ组红色荧光集中在细胞核,提示NLSCBFβ基因表达后进入细胞核发挥生物学功能。对提取的外泌体进行纳米粒径分析,发现外泌体的平均直径为159 nm,其中分布最多的是139 nm,直径在124～201 nm之间的占80%,说明得到的外泌体纯度较高。Simple western实验分析了AAV-293细胞与外泌体的表面标记物（Calnexin、CD81、CD63、TSG101）,结果显示外泌体标志蛋白CD81、CD63、TSG101阳性,而Calnexin呈阴性,符合外泌体的鉴定标准。流式细胞技术分析结果显示,收集并培养的SF-MSCs的CD34（0.6%）和CD45（0.2%）呈阴性,CD90（98.2%）、CD73（100.0%）和CD105（93.2%）呈阳性,符合MSCs的蛋白表型。q RT-PCR检测SF-MSCs的CBFβ基因表达水平,结果提示24 h时,转染r AAV-NLS-CBFβ-RFP组（1.10±0.08）和r AAV-CBFβ-RFP（1.12±0.06）组,较对照组（0.74±0.05）与空白组（0.70±0.02）表达水平升高;48 h时,r AAV-NLS-CBFβ-RFP组（2.30±0.15）和r AAV-CBFβ-RFP（2.05±0.25）组,较对照组（1.17±0.16）与空白组（1.37±0.15）表达水平升高。外泌体与SF-MSCs共孵育48 h后,Exo-r AAV-NLS-CBFβ-RFP（0.0047±0.0024）组和Exo-r AAV-CBFβ-RFP（0.0016±0.0015）组,基因表达量较KGN（0.2043±0.0086）组低（P＜0.01）;与空白组（0.0201±0.0110）比较,其差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:成功分离并培养了关节液来源的间充质干细胞,且符合干细胞蛋白表型。r AAV-NLS-CBFβ-RFP和r AAV-CBFβ-RFP载体成功构建,能够有效感染SF-MSCs。NLS-CBFβ基因表达后可靶向细胞核。Exor AAV-NLS-CBFβ-RFP和Exo-r AAV-CBFβ-RFP成功提取,初步研究结果提示外泌体可携带r AAV-NLS-CBFβ-RFP和r AAV-CBFβ-RFP进入SF-MSCs,但其生物学效应尚需进一步研究。该研究为进一步探讨NLS-CBFβ基因在诱导SF-MSCs成软骨分化中的效应提供一定的研究证据。
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