乳腺癌发病率呈逐年上升趋势,已成为威胁女性健康的最大杀手。紫杉醇是乳腺癌化疗治疗的一线用药,单用和联合应用均显示很好的疗效,但其非选择性会引起严重的全身性毒副作用。肿瘤生物靶向治疗是以肿瘤标志性分子作为靶点,将药物特异性地运送到肿瘤部位,而不影响正常细胞。HER2是公认的重要乳腺癌分子标志物,HER2靶向的单克隆抗体药物曲妥珠单抗已获得FDA批准为一线治疗药物。曲妥珠单抗联合紫杉醇化疗显著提高了乳腺癌的临床疗效,可紫杉醇的靶向性仍旧不足。虽然抗体药物偶联物(ADC)靶向性强,但连接物的构建技术壁垒高,偶联物的位置和数量不易控制。脂质纳米粒作为新型给药系统,具有良好的生物相容性、低毒性及缓控释作用。曲妥珠单抗作为靶向配体与脂质纳米粒结合,不仅实现了化疗药物的缓释性和靶向性,而且制备工艺相对简单。现有配体偶联方法是将曲妥珠单抗通过化学键结合在纳米粒表面,化学反应易导致抗体变性失活,非特异性连接部位也可能出现在抗原识别区域。如何最大程度的保留抗体的生物活性,成为抗体作为化疗药物载体靶向配基的应用关键。本文先后采用聚乙烯亚胺(PEI)和阳离子磷脂(DODMA)作为基质,与其它材料混用制备阳离子纳米粒,通过静电作用与带负电的曲妥珠单抗相结合。通过对曲妥珠单抗的结构及生物活性进行表征,证明了温和的静电力能够很好的保护抗体的生物活性。通过对纳米粒的基质处方、抗体连接策略及连接配比进行优化,制备高效低毒的靶向纳米粒,并对其体外抗肿瘤效应和肿瘤靶向进行初步研究。具体内容主要包括以下几个部分:1.紫杉醇PEI阳离子纳米粒的制备和评价本章选用四种类型PEI(800-b PEI,2000-b PEI,25k-b PEI和25k-l PEI)与PLGA、Egg PC混用制备PEI阳离子纳米粒,以粒径电位为指标,对PLGA/Egg PC含量比、PEI类型及含量进行优化,最佳的阳离子纳米粒处方为PLGA/Egg PC(60:20),PEI类型为25k-b PEI,PEI含量为5%。阳离子纳米粒的粒径大小为249.9±4.76 nm,电位为35.3±2.3 m V。与游离PEI相比,空白阳离子纳米粒对A549细胞和MCF7细胞无明显毒性,相对细胞活力均在90%以上。稳定性结果表明,静置2周后,阳离子纳米粒在PBS(10 m M,p H 7.4)中粒径大小和PDI均未发生明显变化。细胞毒性及细胞摄取实验中,由25k-b PEI制备的紫杉醇PEI阳离子纳米粒在A549和MCF7细胞中均具有最高的细胞毒性(P<0.001),其细胞摄取效率明显高于其它三种PEI制备的纳米粒(P<0.01)。2.曲妥珠单抗修饰的紫杉醇PEI阳离子纳米粒的制备和评价本章分别通过静电吸附作用和化学交联键将曲妥珠单抗与紫杉醇PEI阳离子纳米粒相结合。粒径增加、电位下降以及TEM观察到的双层核壳结构均证明了抗体的成功连接。静电吸附法制备的靶向纳米粒粒径大小为280.7±7.8nm,表面电位1.00±0.73 m V。阳离子纳米粒与曲妥珠单抗的最佳连接配比为1:1,BCA法检测此时抗体结合效率为92.7±0.6%。24 h时,曲妥珠单抗在生理条件下的解离百分率为23%。靶向纳米粒体外释放呈双相缓释模式,6 h内突释率为28.6%,120 h内累计释放率为71.2%。细胞毒性试验中,选用HER2过表达的BT474细胞及低表达的MCF7细胞为实验对象。靶向纳米粒的细胞增殖抑制作用呈受体依赖性和时间依赖性。72 h后,静电吸附法和化学交联法制备的靶向纳米粒对BT474细胞的抑制率分别为53.3%和34.9%(P<0.001)。采用双荧光模式标记靶向纳米粒:FITC标记曲妥珠单抗,Rhod·B标记阳离子纳米粒。在BT474细胞中,静电吸附法制备的靶向纳米粒的FITC和Rhod·B平均荧光强度均明显高于化学交联法(P<0.001)。MCF7细胞中,二者显示了同等水平的荧光强度。在细胞摄取过程中,靶向纳米粒表面的曲妥珠单抗没有发生解离现象。3.曲妥珠单抗修饰的紫杉醇阳离子脂质纳米粒的制备和评价本章采用毒性更低、生物相容性更好的阳离子磷脂DODMA替代阳离子聚合物PEI与PLGA混用制备阳离子脂质纳米粒,随后结合曲妥珠单抗。为了准确控制纳米粒表面抗体数目,采用三种不同抗体连接策略制备靶向脂质纳米粒:(1)将曲妥珠单抗与DSPE-PEG2000-Mal分子连接,再通过静电吸附作用结合到DODMA/PLGA纳米粒表面,即Improved pre-conjugation strategy(Imp);(2)将曲妥珠单抗与DSPE-PEG2000-Mal分子连接,然后与其它基质(DODMA/PLGA)通过物理混合制备纳米粒,即Pre-conjugation strategy(Pre);(3)曲妥珠单抗通过化学交联键结合到DSPE-PEG2000-Mal/DODMA/PLGA纳米粒表面,即Pos-conjugation strategy(Pos)。抗体密度分析结果显示,Imp、Pre和Pos总抗体装载量分别为17.8%,14.5%和4.1%,其中表面抗体含量分别为17.8%,6.12%和4.1%。Pre中,8.38%抗体在制备过程中浪费在纳米粒内部。Pos显示了较低的抗体连接活性。Imp中,对抗体装载量与投药量进行线性拟合,曲线R2为0.995。结果显示通过Imp定量控制纳米粒表面抗体的数目是可行的。细胞毒性试验中,靶向纳米粒的细胞增殖抑制作用呈受体依赖性与剂量依赖性。Imp中,当曲妥珠单抗装载量增加17.8%时,48 h后BT474细胞抑制率提高了7.3%(P<0.001)。Imp灵活的给药方式,有利于实现曲妥珠单抗和紫杉醇之间的协同效应。三种策略构建的纳米粒的细胞毒性由高到低顺序依次为Imp>Pre>Pos,均高于无抗体包被的纳米粒及游离紫杉醇。在BT474细胞中,Imp内化荧光水平最高,其次为Pre和Pos,分别为30.3,23.6和20.7。靶向纳米粒在MCF7细胞中整体内化荧光水平比BT474细胞中要低。最后考察了细胞内吞抑制剂对靶向纳米粒的内吞途径的影响,结果表明靶向纳米粒主要是通过HER2受体及网格蛋白介导的内吞作用进入肿瘤细胞。目前,国内外关于配体偶联策略的研究报道主要集中在化学修饰法连接靶向配体。然而在化学反应中,抗体的活性极易遭到破坏,从而影响其靶向性。高强度的化学键也会阻碍受体-配体识别过程及后续化疗药物的释放。本文采用静电力将抗体结合到阳离子纳米粒表面,极大的提高了抗体的结构稳定性及生物活性。此外,Imp能够准确控制纳米粒表面抗体数目,在一定范围内具备调控纳米粒的靶向能力。曲妥珠单抗修饰的紫杉醇阳离子脂质纳米粒为靶向载体的研发提供理论依据、方法参考和技术借鉴。