脑细胞外基质结合bFGF发挥对帕金森模型动物的神经保护作用

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研究目的:帕金森病是一种常见的神经退行性疾病,因具有进行性、多发性和起病隐匿等特点仍无法根治。纹状体-黑质神经递质代谢紊乱是产生帕金森运动症状的主要原因之一。近年来,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)被广泛研究作为一个治疗中枢神经系统(CNS)疾病的潜在的药物,其对帕金森病具有良好的治疗效果。然而,bFGF的临床使用效果受限于其短半衰期,高血流清除率及低生物稳定性等。作为生物天然材料,由细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)构成的生物支架广泛用于多种组织和器官的构建,包括临床前动物模型和临床应用。为开发以ECM为基础的生物支架的新型使用方式,将ECM作为bFGF载体,利用ECM成分与生长因子的相容性,增加bFGF的稳定性,以促进bFGF对帕金森疾病的神经保护作用。本研究通过化学萃取法制备无细胞核残留、细胞外基质成分高、生物相容性好的脑去细胞外基质,将其与bFGF共孵育,并将包含有bFGF的脑去细胞基质分别作用于6-羟基多巴胺(6-OHDA)作用的PC12细胞以及帕金森模型大鼠,观察脑去细胞基质对bFGF生物活性的影响,并分析其对体内外帕金森模型的药理作用、制剂疗效及可能涉及的机制通路。  方法:(1)应用化学萃取法制备脑细胞外基质,并进行相关的质量评价。通过扫描电镜观察脑去细胞外基质(dcBECM)的微观形态,MRI结果观察其影像学形态,用HE染色,荧光DAPI染色、免疫组化分析其去细胞化的效果。用细胞存活率及MRI影像结果来分析脑细胞外基质的体内外生物相容性。  (2)制备脑细胞外基质复合bFGF(bFGF+dcBECM),Elisa法检测bFGF体内外释放浓度,分析脑去细胞基质对bFGF生物活性的影响。  (3)用6-OHDA损伤的PC-12细胞构建体外帕金森病模型,并给予脑细胞外基质复合bFGF进行治疗。通过CCK-8实验评价细胞存活率,评价bFGF+dcBECM对体外帕金森病模型的疗效。用雄性SD大鼠经纹状体内定位给予6-OHDA建立帕金森病模型,并颅内给予bFGF+dcBECM,来评价bFGF+dcBECM对体内帕金森病模型的疗效。以阿扑吗啡诱导实验评价bFGF+dcBECM对帕金森模型大鼠的行为学改善情况;通过免疫组化染色和Western Blot考察损伤侧黑质内酪氨酸羟化酶(TH)、神经元和bFGF等的变化,考察bFGF+dcBECM经颅内治疗对帕金森模型大鼠的疗效以及相关的通路机制。  结果:(1)制得的脑细胞外基质(dcBECM)外形完整,无细胞残留,且保留了细胞外基质主要成分,如胶原蛋白,纤维连接蛋白,层黏连蛋白及粘多糖等。CCK-8实验结果显示dcBECM不仅与PC12细胞有良好的细胞相容性,还能略微提高细胞生存率。MRI影像结果显示dcBECM组织与大鼠脑组织具有良好的生物相容性。  (2) bFGF+dcBECM在体外10h后其bFGF累计释放量达75.88%。同时,大鼠脑部经bFGF+dcBECM颅内治疗后结果显示,在治疗后12h-3d内,bFGF在大鼠脑内纹状体区表现为缓控释放,并且bFGF在大鼠黑质区内缓慢降解,延长bFGF在黑质区的作用时间。  (3)帕金森病模型大鼠的行为学改善情况和损伤侧黑质内TH的增加表明dcBECM可介导bFGF经颅内入脑进入中枢神经系统,dcBECM发挥对bFGF的缓控释放,提高bFGF在脑内发挥多巴胺能神经元保护作用。大鼠损伤侧显著增加的bFGF、Neun和GFAP表明bFGF+dcBECM发挥对帕金森病模型大鼠的多巴胺能神经元保护作用。同时,PErk/Erk的表达含量下降显示bFGF+dcBECM可能与调节Erk及其通路的变化有关。  结论:去细胞化的脑组织保留了天然的组织结构及细胞外基质蛋白,且具有良好的生物相容性。脑细胞外基质作为免疫反应低、生物相亲性高的生物天然载体,发挥对bFGF缓控释作用,提高bFGF在体内外的生物利用度。脑去细胞基质复合bFGF经颅内给药,可绕过血脑屏障直接递送bFGF进入中枢神经系统,提高bFGF在帕金森大鼠纹状体-黑质区的作用时间,促进bFGF对帕金森病的损伤保护作用。
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