胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)来源于胚胎发育囊胚阶段的内细胞团,可以分化成机体三个胚层来源的所有组织细胞。自从1981年由Evans和Kaufman等建立了首个鼠ES细胞系及1998年Thomson等分离得到人ES细胞以来,ES细胞研究得到了长足发展,目前仍是生命科学研究热点之一。ES细胞的多向分化潜能使其在临床再生医学领域有巨大应用前景,然而发挥ES细胞在临床治疗方面巨大作用的前提是如何在体外扩增ES细胞,并保持其全能性。人ES细胞在体外培养时容易自发分化,因此需要将其培养在胚胎成纤维细胞上或利用添加细胞因子的条件培养基维持不分化,然而这些方法都较繁琐,不适合大规模培养,并且可能造成外源性蛋白污染。要找到一种更适合更简便的人ES细胞培养条件,首先必须要了解维持人ES细胞自我更新和多潜能性的分子机制。先前文献研究报道显示:多种因素参与调控人ES细胞自我更新,其中包括转录因子(Oct4、Nanog、Sox2等),信号通路(TGFβ信号通路、WNT信号通路、FGF和PI3K信号通路等),细胞周期调控因子,microRNA,染色体稳定性及DNA甲基化等。Oct4、Nanog、Sox2是目前研究较多的参与调控人ES细胞自我更新的转录因子,它们在人ES细胞中高表达,通过抑制人ES细胞向某一胚层分化来维持人ES细胞多潜能性,并且它们之间可相互作用形成复杂的转录调控环路,共同维持人ES细胞的多潜能性。近来研究报道除上述几个关键基因外,人ES细胞中还存在其它已知或未知基因参与其自我更新的调控过程,然而日前它们在人ES细胞中的功能及调控机制远未阐明。为了探索和揭示除Oct4、Nanog、Sox2外其它维持人ES细胞多潜能性的基因及其功能,更深入地阐明人ES细胞自我更新的复杂机制,本课题开展了人ES细胞自我更新相关基因的高通量筛选,并且进行了人ES细胞自我更新相关新基因的克隆和功能及转录调控研究。【人胚胎干细胞和拟胚体基因表达谱的初步分析】基因芯片为高通量基因表达研究提供了一个有利工具。本研究中采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片分析比较了未分化人ES细胞(H9)和分化7天的拟胚体(7-day embryoid bodies,7-day EBs)基因表达谱,检测到在人ES细胞分化形成的7-day EBs中约1100个基因表达下调大于2倍及2200个基因表达上调2倍以上,并通过real-time PCR证实了芯片结果的可靠性。在表达下调2倍及以上的基因中,包含了许多已经证实在维持人ES细胞自我更新中发挥重要作用的基因。例如:Oct4表达下调约14倍,Nanog表达下调约17倍,Sox2表达下调约2.6倍。目前已初步揭示在维持人ES细胞多潜能性过程中发挥一定作用的基因也被检测出在7-day EBs中表达显著下调。例如:TDGF1表达下调约11倍;LEFTB表达下调约42倍,DNMT3B下调约8倍等。此外,基因芯片检测结果中包含了大量未知基因(假定蛋白和EST序列),这些未知基因在人ES细胞分化时表达显著改变,但它们的完整基因序列目前仍未获得。其中两个EST序列(GenBank登录号:BF223023、BC020935)在人ES细胞中表达水平较高,尤其是BF223023在未分化人ES细胞中表达水平与Oct4和Nanog相似,而当人ES细胞分化形成EBs时其表达显著下调(19.7倍),并且在多篇文献报道的芯片结果中均有出现,提示我们该EST所代表的基因可能与人ES细胞自我更新调控相关。为了在高通量水平分析人ES细胞分化的早期分子事件,我们又对芯片结果中表达下调和上调2倍及以上的基因进行了基因归类注解分析(Gene Ontology,GO)。通过GO网站在线分析,我们得到每个基因最具代表性的GO术语。根据基因功能分类注释研究我们也发现表达改变2倍及以上的基因包含大量与细胞分化和胚胎发育相关的基因。由此可见,GO分类注释为我们研究与人ES细胞分化和自我更新机制以及胚胎发育过程的分子事件提供了重要线索。【人胚胎干细胞特异性高表达新基因的克隆和鉴定】将BF223023作为种子序列,在人EST数据库中寻找与其匹配的序列,之后利用手工方法将所检索到的EST重叠群拼接获得一个长度约2330bp的序列。检索NCBI网站的人类非冗余基因数据库未发现其它基因与该序列匹配,说明该基因是一个新基因,我们将其命名为人胚胎干细胞相关基因(Human embryonic stem cell related gene,HESRG)(GenBank登录号:DQ445779)。HESRG新基因序列3’端包含一个polyA尾及AATAAA加尾信号,说明该序列包含完整3’非翻译区。但是从基因序列分析尚不能确定其5’末端完整性,因此我们利用Smart RACE PCR试剂盒扩增该基因完整的5’末端。最终我们得到:HESRG基因cDNA序列的全长为3141bp,定位于人类染色体3p14.3。将该基因与NCBI中非冗余核酸数据库进行比对,结果显示HESRG基因仅与人类及类人猿的基因组序列匹配,在其它物种中均未发现有相似序列,提示HESRG基因可能是一种灵长类动物ES细胞特异性表达的新基因。通过Northern blot确定在人ES细胞中HESRG的两个转录本,分别是3.1Kb和1.2Kb。利用NCBI网站的ORF Finder在线程序预测HESRG基因编码框架(open reading frame,ORF)。结果显示HESRG的mRNA序列包含两个候选ORFs,它们均可能编码蛋白质。候选ORF-1的起始密码子CTG位于2-4bp处,终止密码子位于668-670bp处;候选ORF-2的起始密码子ATG位于2245-2247bp处,终止密码子位于2485-2487bp处。ORF-1编码包含222个氨基酸的蛋白质HESRP-1,预测分子量为24KD,理论等电点为9.37,包含亮氨酸拉链结构及蛋白激酶C磷酸化位点,在线软件LOCtree预测该蛋白表达定位于细胞核内。HESRP-1与多个假定蛋白有较高同源性,并与核糖核苷酸二磷酸还原酶(RNR)及E2F家族成员E2F-7有部分同源性。根据生物信息学分析我们推测HESRP-1可能作为转录因子,参与组织发育和细胞分化过程。ORF-2编码蛋白质HESRP-2的预测分子量为8.7KD,理论等电点为5.75,无典型蛋白结构域,含有4个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个肉豆蔻酰基位点,可能存在一个疏水区和2个hotloops结构,与两个假定蛋白序列具有较高同源性。由于HESRP-2缺少保守结构域、缺乏已知同源蛋白,因此较难预测其功能。启动子是控制转录起始,并决定基因表达强度的序列,它在转录调控中扮演非常重要角色。我们提取HESRG基因转录起始位点上游2000bp序列,采用Neural Network Promoter Prediction程序在线预测显示,位于转录起始位点上游2000bp序列中包含了多个候选启动子区,提示该区域可能具有启动子活性。转录因子的结合位点是转录因子调节基因表达时,与基因调控区结合的特异性DNA序列。我们采用Transcription ElementSearch Software(TESS)程序在线预测HESRG基因转录起始位点上游2000bp的序列中包含的转录因子结合位点,发现该区域包含许多转录因子结合位点,如Oct4、Oct1、SRY、LEF1和TCF1等。Oct4是维持人ES细胞自我更新的一个关键基因,在人ES细胞中高表达,由此我们推测HESRG基因可能是Oct4在人ES细胞中调控的靶基因之一。以上生物信息学分析为我们开展HESRG基因功能和转录调控研究提供了线索。HESRG基因在人ES细胞中高水平表达,而在正常胎儿组织、成人正常睾丸组织、多种肿瘤和正常细胞系中均不表达,说明HESRG基因表达具有特异性,可能仅在多潜能性干细胞中表达。为了证明HESRG基因是人ES细胞多潜能性标志基因之一,我们采用多种方法诱导人ES细胞分化。利用RT-PCR方法检测HESRG、Oct4及Nanog在这些组织和细胞中的表达水平。结果显示在分化7天、14天、21天的EBs中HESRG表达水平较人ES细胞中显著降低,且随分化时间逐步降低;在维甲酸(Retinoic acid,RA)诱导的分化细胞和人ES细胞接种到SCID鼠体内形成的畸胎瘤中未检测到HESRG表达。HESRG表达变化趋势与Oct4和Nanog相似。Oct4和Nanog已被证明是ES细胞多潜能性的标志基因,在维持ES细胞自我更新中发挥重要作用,因此根据以上结果我们初步揭示HESRG是一个新的人ES细胞多潜能性标志基因,可能参与维持人ES细胞的多潜能性。【HESRG基因的功能及转录调控研究】RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来兴起的一项研究基因功能的新技术,以其简便、高效和特异等优点,渐已成为基因功能缺失研究的首选策略。为了在人ES细胞中建立高效RNAi方法,我们平行比较了三种转染试剂Lipofectamine RNAiMAX(RNAiMAX)、Lipofectamine2000和Oligofectamine转导siRNA进入人ES细胞所得到的RNAi效率。结果显示,同样条件下RNAiMAX介导的RNAi效率(＞80%)显著高于其它两种转染试剂,说明RNAiMAX是一种高效的siRNA转染试剂,同时也表明我们在人ES细胞中建立了一个高效、简便的RNA干扰方法,为我们进一步研究人ES细胞中HESRG基因的功能提供了帮助。结合基因芯片结果、HESRG表达特征检测及生物信息学分析,我们推测HESRG在维持人ES细胞自我更新中发挥重要作用。进一步我们利用RNAi方法探索HESRG基因在人ES细胞中的功能,研究结果显示:当HESRG基因表达显著下调(约75%)时人ES细胞出现明显的形态学改变,由原先的紧密克隆性生长、增殖速度较快转变成分散、细长、出现丝状物、细胞增殖缓慢状态,而非打靶序列(阴性对照)转染后细胞形态未发生明显改变。Real-time PCR检测结果显示:与非打靶序列转染后的细胞相比较,干扰HESRG的细胞中多潜能性标志基因均出现显著下调;而外胚层分化标志基因Sox1、FGF5和Nestin表达明显升高,尤其Nestin表达升高最为显著,其它胚层的标志基因的改变不明显。进一步利用间接免疫荧光法在蛋白质水平上检测了Oct4、Nestin、Hand1、GATA4和CGβ在干扰前后的表达,结果显示:在非打靶序列转染后的人ES细胞中Oct4高表达,而Nestin、Hand1、GATA4和CGβ表达极其微弱或不表达;在HESRG干扰的细胞中出现较强的Nestin荧光信号,而Oct4的荧光信号则显著下调,其它蛋白的荧光信号改变均不明显。由此证明HESRG基因可以抑制人ES细胞向外胚层分化,从而参与维持人ES细胞的多潜能性。转录调控是真核生物基因表达调控的主要方式,顺式调控元件在很大程度上决定了基因转录的精确起始及效率。定位和克隆目的基因启动子是研究基因转录调控的关键。根据生物信息学预测的结果,我们采用PCR方法扩增了HESRG基因转录起始位点上游-2049/+11区域的DNA序列,并利用荧光素酶报告基因系统证明该段序列具有启动子活性。生物信息学预测显示,HESRG基因启动子区域包含与Oct4转录因子结合位点。为了揭示Oct4对HESRG的调控作用,我们构建了包含Oct4结合位点突变体的报告基因载体,检测发现当Oct4结合位点中两个碱基发生突变后,在人ES细胞中HESRG基因启动子活性显著降低;进一步特异性地抑制人ES细胞中Oct4表达,HESRG基因启动子活性同样明显降低;相反在HEK293细胞中外源性Oct4可显著增强HESRG基因启动子活性;另外染色质免疫沉淀实验也证实转录因子Oct4可以直接结合于HESRG基因启动子区的Oct4结合位点上。上述实验结果说明Oct4对HESRG基因具有直接的正调控作用。总之,通过本课题研究,我们获得了未分化人ES细胞和7-day EBs之间的基因表达谱及差异表达基因信息;根据一个差异表达显著的EST序列克隆得到HESRG新基因,并对HESRG基因进行了较全面的生物信息学分析,详细探讨了HESRG基因表达分布及其与人ES细胞多潜能性的关系,初步揭示了HESRG基因在人ES细胞中的功能及其转录调控机制。这些研究结果将有助于全面了解维持人ES细胞自我更新的分子机制,明确HESRG基因在人ES细胞自我更新中的作用,并为其潜在的临床应用提供科学理论和实验依据。