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Galectins又被称作半乳糖凝集素,为β-半乳糖苷结合蛋白,人体至少存在14种。与其它生物凝集素不同,Galectins成员都包含有大约130个氨基酸的糖类识别区(carbohydrate-recognition domains;CRD),Galectin-1为其成员之一。现有的许多研究显示,Galectin-1与受体的结合可启动多种信号转导途径,参与细胞的黏附、增殖、凋亡和炎症反应等多种生理病理过程,并在免疫系统及肿瘤发生发展中发挥重要作用。首先,Galectin-1在免疫系统中发挥重要作用,Galectin-1可诱导T细胞凋亡并具有抗炎功能,通过与其受体相互作用,Galectin-1还可抑制微生物的感染。其次,Galectin-1在肿瘤形成中发挥重要的作用,它可参与肿瘤细胞的转化,通过与整合素分子结合或调节整合素分子的表达来调控肿瘤转移过程,并可诱导肿瘤侵润的淋巴细胞发生凋亡,Galectin-1还可参与肿瘤局部血管的新生。为了研究Galectin-1的功能,根据GenBank中Galectin-1基因序列,并通过PCR方法从重组质粒pcDNA3.1-Gal-1中扩增获得Galectin-1基因的编码区,将该片段连入pGEM-T克隆载体,获得重组质粒pGEMT-Gal-1,经测序鉴定后,将正确的Galectin-1基因连入原核表达载体pET21a(+),获得重组质粒pET21a-Gal-1。将该重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌。宿主菌经过IPTG诱导,目的基因获得高效表达,经SDS-PAGE和Western blot分析证明为目的蛋白。由于目的蛋白带有His标签,因此利用镍柱对表达产物进行纯化,获得纯度达85%以上的目的蛋白。使用Lowry法对蛋白质进行定量,红血球凝集实验证实获得的Galectin-1蛋白具有较好的活性。虽然获得的C端融合有His标签的目的蛋白具有较高的纯度和较好的活性,但蛋白在隔夜之后会出现沉淀,即使对纯化过程和样品的储存条件进行了多种改进,包括立即进行透析、改变缓冲液、加β-ME、甘油和PEG,但都没获得较好的结果,目的蛋白仅在很低的浓度下不发生沉淀。考虑到谷胱甘肽转移酶GST可增加融合蛋白的可溶性,遂重新扩增Galectin-1基因,并将其克隆到带有GST和His标签的pET42a(+)质粒,获得含有正确目的基因的重组质粒pET42a-Gal-1。将该表达载体转化BL21(DE3)。宿主菌经IPTG诱导后, SDS-PAGE显示获得大小与预期相符的蛋白表达。利用镍柱对表达产物进行纯化,纯度可达85%以上,接着用GST柱对目的蛋白进一步纯化。证明蛋白质的溶解度增加,红血球凝集实验证明蛋白活性增加5～6倍。为了研究Galectin-1对肿瘤细胞体内和体外生长的影响,本研究选择RNAi的方法抑制Galectin-1表达阳性细胞中该蛋白的表达,然后观察细胞周期的变化,及其对肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤性的影响。首先通过RT-PCR对多株人源细胞进行Galectin-1的表达分析,筛选获得Galectin-1表达阳性及表达阴性的细胞株,并进一步用Western blot进行鉴定,证实多株肿瘤细胞表达Galectin-1。考虑到HeLa细胞在裸鼠体内具有较好的成瘤性,故选择其进行进一步研究。根据siRNA的特征,在Galectin-1基因中选择了两段序列作为siRNA作用的靶点,每个靶点设计并合成两条互补的寡核苷酸链,将其变性退火后连入pSilencer质粒,分别获得重组质粒pSilencer-RNA1和pSilencer-RNA2。测序分析表明载体已成功构建。通过电转染法将pSilencer-RNA1和pSilencer-RNA2分别导入到HeLa细胞中,利用400μg/ml潮霉素筛选抗性克隆,然后对挑取的克隆进行RT-PCR鉴定,获得多个Galectin-1表达降低甚至检测不出的克隆。对照细胞为pSilencer转染后挑取的潮霉素抗性细胞。通过MTT法检测Galectin-1表达降低对肿瘤细胞体外生长的影响时,发现Galectin-1的表达变化对肿瘤细胞的体外生长情况没有影响。将Galectin-1基因沉默的HeLa细胞注射裸鼠背部皮下,观察裸鼠成瘤情况的变化。结果表明,Galectin-1基因沉默的肿瘤细胞在裸鼠体内形成的肿瘤明显小于对照细胞形成的肿瘤,经统计分析具有统计学意义,说明抑制Galectin-1基因的表达可抑制肿瘤细胞在体内的生长,Galectin-1可作为肿瘤治疗的潜在靶点。本研究为进一步研究Galectin-1的功能奠定了良好的基础。