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研究背景： 常染色体显性新生血管炎症性玻璃体视网膜病变（ADNIV）是一种常染色体显性遗传性自身免疫性眼病，其同时拥有多种常见眼病的病理特征，包括：自身免疫性葡萄膜炎、视网膜色素变性、增生性糖尿病性视网膜病变和增生性玻璃体病变，而这些病理特征正常情况下不会同时出现。其特殊性还在于炎症反应仅表现于眼部，而不引起全身性病变。ADNIV一般分为五个阶段，每个阶段出现不同的病理特征，病程长达数十年。患者会由最初的轻度的后葡萄膜炎随着眼内慢性炎症不断积累，逐渐出现光感受器病变，视网膜新生血管形成，玻璃体出血及眼内纤维化等一系列病变造成视力逐渐退化最终导致失明。由于其同时具有多种常见眼科疾病的病理特征，很容易和其他眼科疾病混淆，与其他疾病区分的主要方式之一为发病初期ERG检查表现为b波的降低，a波正常或相对升高，并且此病病程过长因此很难确诊，所以其分子机制仍不十分明确。目前，CAPN5基因突变是已报道的ADNIV唯一已发现的致病基因。 CAPN5编码钙蛋白酶5（calpain-5），一种半胱氨酸蛋白酶，属于钙蛋白酶家族的成员。钙蛋白酶参与细胞内的各种钙依赖性细胞进程，包括：信号转导、细胞周期、细胞的增殖、分化、迁移、细胞凋亡、膜融合和肌纤维的形成等。Vinit B. Mahajan和他的同事将ADNIV定位于11q13，发现致病基因CAPN5，该基因含有13个外显子，突变基因位于6号外显子上。钙蛋白酶在生理条件Ca2+浓度下调节机制仍不清楚，但通过对ADNIV突变基因的研究发现该突变是增加了钙蛋白酶的催化活性。通过对转基因小鼠视网膜的炎症因子研究发现，转基因小鼠视网膜发育早期的表达就有所改变，这也预示了存在潜在的药物靶点。 目的： 1.本论文先通过对中国的1个汉族ADNIV患者家系的候选致病基因进行筛查； 2.通过筛查出的致病基因制作与病人突变一致的小鼠疾病模型，通过视功能检查和形态学研究等来探究CAPN5基因突变所致ADNIV的机制。 方法： 1.研究对象 该ADNIV家系中包括9名患者和33名正常家系成员，先证者就诊于温州医科大学附属眼视光医院，该患者眼部病理特征表现为：视力降低、白内障和视网膜色素变性，并伴随有轻度的听力异常。该患者及其母亲均为ADNIV患者，但该患者妹妹正常。 2.实验方法 1）家系收集和突变位点的筛选 通过临床诊断及鉴别后收集1个汉族ADNIV家系，详细记录家族史及临床表征，绘制家系图，经患者本人及家系成员或监护人同意后，采集外周静脉抗凝血5ml。采用苯酚-氯仿基因组抽提法，提取基因组DNA，检测提取样品的DNA浓度，-20℃保存。以家系中的所有先症者基因组为模板，采用聚合酶链式反应（PCR）扩增候选基因CAPN5的全部外显子和外显子-内含子的连接部分。PCR纯化后的样品，直接进行扩增片段测序。对测序结果进行分析，若发现存在基因突变，进一步确认该突变位点为致病突变。 2）基于疾病模型的研究 ADNIV疾病小鼠培育采用Cre／loxP和Flp/FRT双重组酶系统，在突变染色体上插入FRT-Neo-FRT基因序列作为筛选标志，产生带有CAPN5R289W-Neo突变的杂合子小鼠，再与携带Flp基因的小鼠交配，除去Neo序列，繁殖出的疾病小鼠与所筛选家系的基因突变一致，因此以CAPN5R289W杂合子小鼠与同窝仔野生型CAPN5WT小鼠作为研究对象。（1）CAPN5R289W小鼠和CAPN5WT小鼠，在小鼠2月龄、4月龄和6月龄时分别采集眼底照相、ERG、OCT等眼部生物学参数；（2）眼部组织学研究：分别取已采集的眼部生物学参数的2月龄、4月龄和6月龄CAPN5R289W小鼠和同窝CAPN5WT小鼠，眼球取材通过石蜡切片后HE染色进行组织学对比；（3）诱导小鼠眼内炎症生成：①实验组：2月龄CAPN5R289W小鼠；对照组：2月龄CAPN5R289W小鼠和同窝CAPN5WT小鼠；②左眼玻璃体腔注射内毒素（LPS）（1μL，60ng/μL），右眼作为自身对照不注射；③24h后裂隙灯观察；④1周后采集实验组与对照组眼底照相、ERG和OCT等眼部生物学参数；⑤眼球取材通过石蜡切片后HE染色进行组织学对比。 结果： 1.通过对招募到的1个ADNIV家系的CAPN5基因筛查后，在CAPN5基因上发现一个新的基因突变位点； 2.2月龄、4月龄和6月龄CAPN5R289W小鼠和同窝CAPN5WT小鼠分别采集眼底照相、ERG和OCT等眼部生物学参数均未显示出明显差异；利用HE染色进行形态学对比，结果也无明显差异。 3.2月龄CAPN5R289W小鼠与2月龄同窝CAPN5WT小鼠玻璃体腔注射LPS后，裂隙灯观察注射眼均表现出明显炎症反应；视网膜 HE染色结果显示， CAPN5R289W小鼠和CAPN5WT小鼠注射眼均出现视网膜萎缩现象，CAPN5WT仅出现局部的视网膜萎缩，CAPN5R289W出现视网膜萎缩的同时伴有色素细胞的迁移，这预示着相同诱导条件下CAPN5R289W眼部病变可能更容易被激发。 结论： 1.本实验对招募到的一个ADNIV家系进行基因筛查、分析找到一个新的致病突变p.R289W； 2.本实验中经LPS诱导CAPN5R289W小鼠激发了小鼠眼内炎症因子的释放，引起了CAPN5R289W视网膜的萎缩和色素上皮细胞的迁移。