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马铃薯是世界第四大粮食作物,在粮食安全方面发挥着重要的作用。由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病是一种卵菌病害,威胁着马铃薯的生产,被誉为世界上第一大作物病害。在致病疫霉侵染寄主植物的过程中,分泌大量的RXLR效应分子来抑制和破坏寄主植物的免疫反应,达到成功侵染的目的。因此,鉴定重要的RXLR效应分子并挖掘致病机制,对有效防治马铃薯晚疫病具有重要意义。 本研究通过筛选实验室前期构建的251个RXLR类效应分子的基因库,鉴定了致病疫霉HLJ菌株的一个重要效应分子PITG_16427.2HLJ,获得了以下研究成果: (1)通过瞬时表达的方法,在本氏烟中验证效应分子PITG_16427.2HLJ能够抑制INF1诱导的过敏性细胞坏死反应(Hypersensitive cell death Response,HR)。同时发现,该基因还能够抑制包括Bax、PsojNIP、SFI2、Avh238和Avh241诱导的HR,说明该基因能够广谱抑制植物的PTI和ETI。 (2)以致病疫霉标准菌株T30-4中的效应分子PITG_16427.2为参照,对克隆到的17个不同卵菌菌株(致病疫霉、大豆疫霉、辣椒疫霉和烟草寄生疫霉)中的PITG_16427.2进行生物信息学分析。分析结果显示,不同卵菌间的PITG_16427.2共存在11种特异性氨基酸序列,且氨基酸序列的一致性超过93%,表明PITG_16427.2具有高度保守性,可能是病原卵菌中重要的致病因子。抑制细胞死亡试验发现它们均能抑制INF1和Avh241诱导的HR,自然变异并没有影响到致病性分化。 (3)运用荧光定量PCR的方法,证明效应分子PITG_16427.2在致病疫霉HLJ菌株侵染马铃薯品种Désirée的活体营养阶段就能够显著上调表达,与目前鉴定的多数卵菌效应分子相似,这暗示PITG_16427.2在侵染过程中可能发挥重要作用。 (4)在本氏烟及感病马铃薯Désirée中超量表达PITG_16427.2HLJ,能够显著提高寄主对致病疫霉HLJ菌株的感病性。从而证明PITG_16427.2HLJ是一个致病因子。 (5)DAB染色法检测致病疫霉侵染本氏烟后过氧化氢的积累显示:瞬时表达PITG_16427.2HLJ一侧的叶片过氧化氢积累显著低于空载体对照。表明PITG_16427.2HLJ可能通过抑制寄主中活性氧爆发来抑制植物的免疫,增强感病性。 (6)植物激素对植物抗病及抗逆具有重要作用。通过荧光定量PCR的方法,检测水杨酸(Salicylic acid,SA)以及乙烯(Ethylene,ET)合成途径中关键基因的表达情况来初步解析PITG_16427.2HLJ促进致病疫霉侵染植物的机制。在致病疫霉侵染本氏烟48h后,水杨酸信号标志基因PR1b显著下调表达,乙烯信号标志基因EFR1显著上调表达。这暗示在致病疫霉侵染植物过程中,PITG_16427.2HLJ可能是通过抑制SA信号路径,强化ET信号路径来发挥致病性功能。 (7)使用激光共聚焦显微镜观察到PITG_16427.2HLJ定位在植物的细胞膜和细胞核。 综上所述,本研究分析并鉴定致病疫霉HLJ菌株的一个关键效应分子PITG_16427.2,探究了PITG_16427.2的功能,并初步剖析了该基因在侵染植物过程中发挥致病性的机理,为进一步解析效应分子在致病疫霉侵染马铃薯过程中所扮演的角色提供线索。