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菊花Chrysanthemum×morifolium(Ramat)Kitam.原产于中国,是世界最重要的花卉之一,每年都有包括大量切花和盆栽品种在内的丰硕的育种成果。20世纪70年代兴起的转基因技术成为一种新兴的育种手段,可以弥补传统育种方式的不足,加快菊花的育种进程,尤其在花期、花色、花型、株高、株型和抗病虫等性状改良方面起着重要作用,极大地拓宽了菊花品种的育种途径。但是,菊花转基因具有品种特异性强、转化率低,外源基因难以表达等特点。利用甘菊中克隆的LEAFY同源基因DFL构建的载体转化,对于菊花转基因育种来说可以降低科、属之间的差异,利于转入基因的表达。成功的转基因首先依赖于建立良好的再生体系和遗传转化体系。
本研究以与菊花同属的甘菊Chrysanthemumlavandulifolium(Fisch.exTrautv.)为试验材料,以种子(瘦果)为外植体进行组织培养,获得了无菌苗,并通过诱导愈伤产生不定芽的方式建立了甘菊的再生体系。研究了甘菊对不同抗生素的敏感性,建立了遗传转化体系。研究结果表明:
1.利用甘菊种子作为外植体,终浓度0.8%的次氯酸钠溶液灭菌20min,接种于MS培养基中,获得无菌苗。用1/2MS(大量)+0.5%活性炭进行循环切茎繁殖,25d增殖系数可以达到9.6。用MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L做诱导分化培养基,平均每块外植体产生芽数21.5。甘菊和菊花一样易于生根,1/2MS+NAA0.1mg/L可作为生根培养基。生根苗栽入蛭石中培养,成活率95.2%。
2.研究讨论了甘菊对不同抗生素的敏感性。结果表明:甘菊对潮霉素、卡那霉素比较敏感,培养基中添加5mg/L潮霉素或3mg/L卡那霉素,叶盘即不能分化,培养基中添加3mg/L潮霉素和10mg/L卡那霉素,无菌苗即难以生根。羧苄青霉素可以作为合适的转化抑菌抗生素,培养基中羧苄青霉素浓度在300mg/L以上,会对甘菊有一定影响。
3.建立了甘菊的遗传转化体系。甘菊叶盘转化,应先预培养2-4d,在浓度OD600=0.4~0.6之间,1/2MS+1%Mg或5%蔗糖溶液悬浮的菌液中浸泡侵染5min左右。在MS培养基中共培养2d,在分化培养基中延迟筛选培养3d,之后转入分化培养基+5mg/L潮霉素(羧苄青霉素的浓度应为开始500mg/L,后期300mg/L)培养基中分化培养。抗性芽在添加3mg/L潮霉素的生根培养基中生根培养。继续筛选,并对部分抗性植株进行了PCR扩增检测,证明DFL基因已转入到甘菊中。
以上研究成果为今后进一步采用分子育种和常规育种培育提前开花的菊花品种奠定了坚实的基础,对菊花再生体系和转化体系的研究有一定借鉴作用,并且为今后进行菊科植物分子研究提供了充足的试验材料。