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乙型肝炎病毒﹙HBV﹚的感染是引发肝细胞癌﹙HCC﹚的主要危险因素之一。MicroRNA﹙miRNA﹚在调控HBV的复制和致病性等方面起到了重要作用。因此,研究miRNA在HBV相关性HCC﹙HBV-HCC﹚进程中的作用,对于揭示HBV的致病机制具有重要的意义。本研究利用生物芯片技术,筛选在HBV细胞模型中异常表达的miRNA,并利用生物信息学软件预测其靶基因。通过实验研究,筛选得到了与HBV复制相关的miRNA表达谱,进而发现肝组织特异的miR-192的表达与HBV的复制正相关。我们系统地阐述了HBV调控miR-192表达的分子机制,证实了其对靶基因RB1表达的抑制作用。1. HBV复制相关miRNA的筛选及验证为了掌握miRNA在HBV细胞模型中的表达特征,我们以HepG2细胞作为无HBV复制的对照细胞,以2.2.15细胞作为HBV低复制细胞模型,以HepAD38细胞作为HBV高复制细胞模型,筛选在HBV细胞模型中异常表达的miRNA。在鉴定了HBV在上述三种细胞中的复制和表达情况的基础上,我们将从上述细胞中提取的总RNA与miRNA芯片杂交,检测miRNA在这些细胞中的表达水平。结果显示,总RNA的质量符合芯片杂交所需要求;芯片的检测过程得到了良好的质控,不同芯片间的数据具有可比性;通过比较这些表达谱,我们筛选得到了在HBV细胞模型中异常表达的miRNA。此外,我们还应用自主建立的stem-loop qRT-PCR方法验证了芯片结果的有效性。据此筛选得到的在HBV细胞模型中异常表达的miRNA可用于下一步的靶基因预测。2. HBV复制相关miRNA的靶基因预测本研究在HBV基因组和人类基因组中分别预测HBV复制相关miRNA的靶基因,以期比较全面地了解miRNA在HBV-HCC进程中的作用。(1)在HBV基因组中预测HBV复制相关miRNA的靶基因为了研究HBV复制相关miRNA对病毒基因的调控情况,我们根据上一部分研究中的miRNA芯片结果,利用自主建立的生物信息学方法“array-miRTar”,从人源miRNA中筛选与HBV复制负相关的miRNA,进而在HBV基因组中预测这些miRNA的靶基因。分析结果表明,共有29个miRNA与HBV复制负相关,其中4个miRNA能够靶向调控HBV基因。例如,miR-15b是一种与HBV复制负相关的miRNA,并且在S基因和P基因的重叠区存在其可信度较高的靶位点。这些结果提示,miR-15b可能通过直接结合S基因﹙P基因﹚的编码区以抑制其表达。(2)在人类基因组中预测HBV复制相关miRNA的靶基因研究HBV复制相关miRNA对肿瘤相关基因的调控情况,有利于深入揭示miRNA在HBV-HCC进程中的作用。本研究根据上一部分研究中的miRNA芯片结果,从人源miRNA中筛选与HBV复制正相关的miRNA,进而在人类基因组中预测这些miRNA的靶基因。为了掌握这些靶基因在HBV细胞模型中的表达情况,我们采用cDNA芯片检测了HBV细胞模型中mRNA的表达水平。分析结果表明,miR-192是一种与HBV复制正相关的人源miRNA;而RB1是miR-192的高可信度靶基因之一,其mRNA与miR-192在表达水平上呈负相关。这些结果提示,HBV可能通过促进miR-192的表达以抑制RB1的表达,从而促进肿瘤的发生和发展。3. HBV复制相关miRNA﹙miR-192﹚的功能研究为了探讨HBV促进miR-192表达的分子机制,我们分析了HBV编码的不同蛋白对miR-192前体﹙pri-miR-192﹚启动子的活性的影响。结果表明,在HBV编码的蛋白中,HBx的异位表达能够强烈地促进pri-miR-192启动子的活性。研究结果还显示,HBx可以上调miR-192成熟体的表达水平。进一步的研究表明,在pri-miR-192启动子的关键区域中含有一个HNF-1α结合位点,而HBx正是通过该位点调控其启动子的活性。上述实验研究表明HBx可以通过HNF-1α结合位点增强pri-miR-192启动子的活性,从而在转录水平上促进miR-192的表达。为了探讨miR-192抑制靶基因RB1表达的分子机制,我们构建了miRNA真核表达载体以及3’UTR报告基因系统,并将两者用于分析由miR-192介导的RB1的转录后基因沉默。结果显示,miR-192能够抑制含有RB1 3’UTR的报告基因活性,并且这种抑制作用呈剂量依赖效应。实验结果表明miR-192能够在转录后水平抑制RB1的表达,这种抑制作用是通过miR-192与RB1 3’UTR的靶向结合而实现的。4.结论本研究通过分析不同HBV细胞模型中miRNA表达水平的差异,筛选出可能参与调控HBV-HCC进程的miRNA及其靶基因——miR-192和RB1。实验研究揭示了HBx可以通过HNF-1α结合位点增强miR-192启动子的活性;证实了miR-192能够靶向结合RB1 3’UTR从而抑制其表达。本研究所提出的HBx/miR-192/RB1调控模式为深入理解HBV-HCC的进程提供了新的理论依据。