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目的与研究背景
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，而且是女性最常见癌症致死原因，大约有16%的女性因乳腺癌死亡[1]。近年来，尽管乳腺癌患者预后有所改善，但乳腺癌的治疗效果仍需发展，对于终末期远处转移患者犹为重要[1]。此外，药物耐药也给乳腺癌患者治疗带来极大威胁[2]，尤其是药物治疗过程中涉及基因再次突变、多条信号通路的变化，很大程度上限制了化疗药物治疗的有效性。因此，阐明乳腺癌发生、发展和演进的内在分子机制至关重要。
PTEN是位于10号染色体上磷酸酶和张力素同源物，是肿瘤演进中最常见的缺失或突变基因之一。PTEN能够将磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)催化为二磷酸盐产物(PIP2)，进而抑制PI3K通路活化，从而延缓肿瘤的恶性生物学行为[3,4]。PTEN以其抑癌作用而被广泛用于肿瘤研究中。其假基因PTENP1，包含一段与PTEN上游3’-UTR高度同源区域，能够调控PTEN表达，因此在肿瘤发生中表现出一定的调控作用[5]，且PTENP1亦能参与到抑制细胞增殖、促进细胞凋亡及抑制侵袭的过程中[6,7]。同时，PTENP1亦是一种长链非编码RNA(LncRNAs)。近来研究表明，lncRNA作为一种内源竞争性RNA，能够通过结合位点与miRNA相互作用，在调控miRNA功能中发挥重要作用[8]。相关研究显示高水平PTENP1能够靶向解除miR-19b对PTEN的抑制作用，促进PTEN的表达，进而抑制乳腺癌细胞增殖、转移及成瘤能力[6]。可见，miRNA能够直接与下游蛋白编码基因的3’-UTR结合，影响其在病理生理过程中的作用。miR-130a是一种致癌miRNA，能够靶向抑制PTEN，促进肿瘤细胞的增殖，导致肿瘤生长[9]。miR-20a也可作为PTEN的负性调控者，介导多发性骨髓瘤癌细胞的增殖、凋亡及侵袭能力[10]。在本研究中，我们发现PTENP1具有调控miR-20a介导其对乳腺癌演进的生物学作用。
PI3K/Akt信号通路是乳腺癌演进的重要通路之一，该通路激活于受体酪氨酸激酶活化之后，相关研究显示其已成为靶点，具有治疗潜能[11]。异常表达的PTENP1导致PTEN高表达同时抑制PI3K/Akt信号通路，进而阻滞前列腺癌及肾癌细胞的生长过程[12,13]。另一方面，miR-106b和miR-93能够通过抑制PTEN表达来调控乳腺癌细胞增殖、侵袭及转移过程，而这一过程又能通过上调PTEN表达而抑制[14]。这些研究提示PTENP1、miRNAs、PTEN可能与PI3K/Akt通路有关联。通过生物信息学预测分析，我们发现，PTENP1与miR-20a有相互结合序列，但关于miR-20a在PTENP1调控PTEN表达及三者介导乳腺癌演进的过程仍不清楚。
因此，本研究探讨PTENP1、miR-20a及PTEN在乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中的作用及其调控关系；通过上调和下调PTENP1及PTEN等探讨其在乳腺癌演进中的作用；通过进一步分析lncRNAPTENP1、miR-20a这两种非编码RNAs调控PTEN表达，探讨PTENP1/miR-20a/PTEN轴经由PI3K/Akt信号通路，介导乳腺癌生物学行为在演进中的作用机制；以期为临床靶向乳腺癌治疗提供新的潜在靶点。
方法
1、提取乳腺癌组织及细胞株中RNA，应用qRT-PCR方法检测PTENP1及PTEN表达水平。分析PTENP1及PTEN与乳腺癌预后关系。通过qRT-PCR方法检测转染PTENP1、siPTENP1后，乳腺癌细胞株中PTENP1的表达，明确转染效率。
2、特异性上调MDA-MB-231及MCF-7/ADR(阿霉素，adriamycin)细胞中PTENP1表达，检测转染后细胞的增殖、侵袭、药敏性及凋亡水平变化，并检测其对体内成瘤性的影响；特异性下调MCF-7及T47D细胞中PTENP1表达，检测转染后细胞的增殖、侵袭、药敏性及凋亡水平变化，并检测其对体内成瘤性的影响。
3、采用qRT-PCR方法检测乳腺癌组织及细胞株中miR-20a的表达水平；通过双荧光素酶报告实验检测PTENP1、PTEN与miR-20a之间的靶向调控关系；RIP实验验证PTENP1与miR-20a的结合关系；调控miR-20a的表达，采用qRT-PCR方法检测PTENP1与PTEN的表达水平改变。
4、采用qRT-PCR及westernblot方法，检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7/ADR共转染miR-NCmimic、miR-20amimic、Vector及PTENP1后，PTEN表达水平变化，并检测MCF-7、T47D细胞株共转染miR-NCinhibitor、miR-20ainhibitor、siSCR及siPTENP1后，PTEN表达水平改变；采用CCK8及平板克隆实验，检测共转染miR-20a及PTENP1后，乳腺癌细胞株的增殖性的变化；采用Transwell实验，检测共转染miR-20a及PTENP1后，乳腺癌细胞株的侵袭性的变化；采用CCK8实验、计算转染后细胞IC50值变化、通过ADR处理，检测处理后细胞克隆实验以及细胞凋亡实验，检测共转染后细胞药敏性及凋亡能力的变化。
5、将miR-NCmimic、miR-20amimic、vector及PTENP1共同转染至MDA-MB-231细胞中，通过westernblot方法检测PI3K/Akt信号通路活性变化；将miR-NCinhibitor、miR-20ainhibitor、siSCR及siPTENP1共同转染至MCF-7细胞中，通过westernblot方法检测PI3K/Akt信号通路活性变化；用DMSO、LY294002、controlsiRNA及siAkt处理MDA-MB-231细胞后，采用westernblot方法检测信号通路的变化；用DMSO、LY294002、controlsiRNA及siAkt处理MDA-MB-231细胞后，采用平板克隆及Transwell实验检测细胞增殖及侵袭能力的改变。
结果
第一部分PTENP1和PTEN在乳腺癌组织及细胞株中的表达
(1)在52对乳腺癌组织中，PTENP1及PTEN呈显著低表达水平；PTENP1及PTEN在乳腺正常细胞MCF-10A中表达水平最高，在MCF-7及T47D中水平显著降低，而在乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231、耐药株MCF-7/ADR及T47D/ADR细胞株中，表达更低；
(2)PTENP1及PTEN在Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌组织中表达显著高于Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌中表达；
(3)生存分析结果表明，高水平PTENP1及PTEN与患者高生存预后相关，而低水平PTENP1及PTEN通常预示乳腺癌患者的不良预后；
(4)将PTENP1及vector转染至MDA-MB-231、MCF-7/ADR及T47D/ADR细胞中，结果表明PTENP1的水平显著增高；将siPTENP1及siSCR转染至MCF-7及T47D细胞中，结果表明PTENP1的水平显著降低。
第二部分调控PTENP1表达对乳腺癌演进的影响
(1)在MDA-MB-231及MCF-7/ADR细胞中，上调PTENP1后，CCK8实验表明其增殖能力显著降低；平板克隆实验表明，上调PTENP1后，细胞形成克隆能力显著降低；Edu染色及Ki67染色结果均表明转染后的细胞增殖能力显著降低；
(2)转染PTENP1后，MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭能力显著下降；
(3)上调PTENP1表达后，MCF-7/ADR细胞对ADR的耐药性显著降低，对ADR更加敏感；通过计算IC50值，转染后的MCF-7/ADR细胞对ADR的耐受性显著降低；将转染后的MCF-7/ADR细胞，用ADR处理，其细胞克隆能力更为下降；流式细胞仪结果表明，上调PTEP1后，细胞经ADR处理后，凋亡率显著增多；JC-1染色证实线粒体膜电位发生改变；TUNEL实验证实ADR处理后，细胞凋亡的发生；凋亡相关分子水平的改变也证实在上调PTENP1水平后，细胞对药物更为敏感，凋亡水平增强；
(4)上调PTENP1后，转染后细胞的体内成瘤能力减弱，而同时以ADR处理后，瘤体积更小；对上述瘤组织进行石蜡切片染色，免疫组化染色结果表明，PTEN水平显著增强，而Ki67水平显著下降；
(5)下调MCF-7及T47D细胞中PTENP1水平后，CCK8实验表明其增殖能力显著增强；平板克隆实验表明，敲低PTENP1后，细胞形成克隆能力显著增强；Edu染色及Ki67染色结果均表明转染后的细胞增殖能力显著升高；
(6)转染siPTENP1后，与对照组相比，MCF-7细胞的迁移、侵袭能力显著增强；
(7)下调PTENP1表达后，MCF-7细胞对ADR的抵抗性显著增强；通过计算IC50值，转染后的MCF-7细胞对ADR的耐药性增强；以ADR处理转染后的MCF-7细胞，其克隆形成能力显著升高；流式细胞仪结果表明，下调PTEP1后，MCF-7细胞凋亡率显著降低；JC-1染色证实转染后的细胞线粒体膜电位发生改变；TUNEL实验同样证实凋亡的发生；下调PTENP1水平后，凋亡相关分子水平的改变也证实凋亡水平减弱；
(8)敲低PTENP1水平，MCF-7细胞的体内成瘤能力显著增强，而同时以ADR处理后，瘤体积仍增大；对上述瘤组织进行石蜡切片染色，免疫组化染色结果表明，PTEN水平显著降低，而Ki67水平显著增强。
第三部分PTENP1是miR-20a的直接靶点并正向调控PTEN
(1)miR-20a在乳腺癌中的表达显著高于相应癌旁组织中表达；miR-20a在乳腺癌细胞株中表达显著高于正常乳腺细胞株MCF-10A中表达，而且在乳腺癌高转移性细胞株MDA-MB-231中表达高于低转移性细胞株MCF-7、T47D中表达；在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR、T47D/ADR中表达高于非耐药细胞株MCF-7、T47D中表达；
(2)通过统计学相关性分析证实，PTENP1与miR-20a之间存在负性相关关系，Spearman系数为-0.7223；双荧光素酶报告实验结果表明，PTENP1与miR-20a结果存在靶向调控关系；
(3)特异性上调MCF-7及T47D细胞中miR-20a水平后，PTENP1表达显著降低；特异性下调MDA-MB-231、MCF-7/ADR及T47D/ADR细胞中miR-20a水平后，PTENP1表达显著升高；
(4)RIP实验结果表明，在乳腺癌细胞株中，PTENP1和miR-20a存在表达水平富集，说明二者可能存在之间作用关系；
(5)通过统计学相关性分析证实，PTEN与miR-20a之间存在负性相关关系，Spearman系数为-0.7929；双荧光素酶报告实验结果表明，PTEN与miR-20a结果存在靶向调控关系；
(6)特异性上调MCF-7及T47D细胞中miR-20a水平后，PTEN表达显著降低；特异性下调MDA-MB-231、MCF-7/ADR及T47D/ADR细胞中miR-20a水平后，PTEN表达显著升高。
第四部分miR-20a与PTENP1通过调控PTEN表达逆转乳腺癌演进
(1)在MDA-MB-231细胞及MCF-7/ADR细胞中，转染miR-20amimic后，PTEN水平显著降低，转染PTENP1后，PTEN水平显著升高，而当共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对PTEN的促进作用；
(2)CCK8结果表明，在MDA-MB-231细胞及MCF-7/ADR细胞中，转染miR-20amimic后，乳腺癌细胞的增殖性增高，转染PTENP1后，转染后细胞增殖能力降低，共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对转染细胞增殖能力的抑制作用；平板克隆实验也显示了相同趋势；
(3)Transwell结果表明，在MDA-MB-231细胞中，转染miR-20amimic后，乳腺癌细胞的侵袭性增强，转染PTENP1后，细胞的侵袭能力显著降低，共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对细胞侵袭能力的抑制作用；
(4)CCK8结果表明，在MCF-7/ADR细胞中，转染miR-20amimic后，乳腺癌细胞对ADR的抵抗性增强且IC50值增高，转染PTENP1后，细胞的耐药性降低且IC50值减小，共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对细胞耐药性的敏感作用；ADR处理后，MCF-7/ADR细胞的平板克隆能力减小，但转染miR-20amimic组，细胞增殖能力仍最高，而转染PTENP1后，细胞增殖能力降低，共转染后，平板克隆能力有所恢复；在MCF-7/ADR细胞中，转染miR-20amimic后，ADR诱导的细胞凋亡率减少，而转染PTENP1后，ADR诱导的细胞凋亡率增高，共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对细胞细胞凋亡的抑制作用；
(5)在MCF-7细胞及T47D细胞中，转染miR-20ainhibitor后，PTEN水平显著升高，转染siPTENP1后，PTEN水平显著降低，而当共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对PTEN的抑制作用；
(6)CCK8结果表明，在MCF-7细胞及T47D细胞中，转染miR-20ainhibitor后，细胞的增殖性降低，转染siPTENP1后，细胞增殖能力增强，共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对转染细胞增殖能力的促进作用；平板克隆实验也显示了相同趋势；
(7)Transwell结果表明，在MCF-7细胞中，转染miR-20ainhibitor后，乳腺癌细胞的侵袭性减弱，转染siPTENP1后，细胞的侵袭能力显著升高，共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对细胞侵袭能力的促进作用；
(8)CCK8结果表明，在MCF-7细胞中，转染miR-20ainhibitor后，乳腺癌细胞对ADR的抵抗性降低且IC50值减小，转染siPTENP1后，细胞的耐药性增强且IC50值升高，共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对细胞的耐药性；ADR处理后，MCF-7细胞的平板克隆能力减小，但miR-20ainhibitor后，细胞增殖能力降低，转染siPTENP1组，细胞增殖能力最高，共转染后，平板克隆能力有所恢复；在MCF-7细胞中，转染miR-20ainhibitor后，ADR诱导的细胞凋亡率升高，而转染siPTENP1后，ADR诱导的细胞凋亡率减少，共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对细胞细胞凋亡的促进作用。
第五部分PTENP1/miR-20a/PTEN轴通过激活PI3K/Akt通路介导乳腺癌演进
(1)在MDA-MB-231细胞中，转染miR-20amimic后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平显著升高，PTEN水平显著下降，而Akt水平没有发生改变；转染PTENP1后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平显著下降，PTEN水平显著升高，而Akt水平没有发生改变；共同转染miR-20amimic和PTENP1后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平恢复如对照组；在MCF-7细胞中，转染miR-20ainhibitor后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平显著降低，PTEN水平显著升高，而Akt水平没有发生改变；转染siPTENP1后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平显著增强，PTEN水平显著降低，而Akt水平没有发生改变；共同转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平恢复；
(2)通过LY294002处理MDA-MB-231细胞后，与DMSO组相比，PI3K/Akt信号通路活性降低；通过siAkt处理MDA-MB-231细胞后，与controlsiRNA组相比，PI3K/Akt信号通路活性显著降低；
(3)通过LY294002处理MDA-MB-231细胞后，与DMSO组相比，MDA-MB-231细胞的增殖能力显著下降；通过siAkt处理MDA-MB-231细胞后，与controlsiRNA组相比，MDA-MB-231细胞的侵袭能力显著下降；
结论
1.PTENP1和PTEN在乳腺癌组织及细胞株中持续低表达，并且与乳腺癌的临床分期及预后密切相关，在ER阴性的乳腺癌细胞中，PTENP1表达更低；
2.上调乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-7/ADR)中PTENP1的表达，能抑制癌细胞增殖、侵袭，诱导细胞凋亡，增强对阿霉素的敏感性以及减弱体内成瘤能力；下调(MCF-7和T47D)乳腺癌细胞株中PTENP1的表达，则产生相反作用；PTENP1能够介导乳腺癌的演进，发挥抑癌作用；
3.miR-20a在乳腺癌组织及高转移细胞株、阿霉素耐药细胞株持续高表达，提示预后不良。miR-20a与PTENP1和PTEN存在负性靶向调控关系，PTENP1通过吸附miR-20a，解除miR-20a对PTEN的靶向抑制作用；
4.共同调控乳腺癌细胞株中miR-20a和PTENP1的表达，通过改变PTEN水平，介导乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力及对阿霉素药物敏感性发生改变，显著影响乳腺癌演进，而miR-20a能够显著逆转PTENP1对乳腺癌的负调控作用；
5.miR-20a能负靶向调控PTEN的表达水平，增强PI3K/Akt信号通路的活性，从而促进乳腺癌细胞增殖和侵袭；而PTENP1则正靶向调控PTEN的表达水平，降低PI3K/Akt信号通路的活性，降低活性的PI3K/Akt信号通路能够延缓乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。
6.PTENP1/miR-20a/PTEN轴由经PI3K/Akt通路介导乳腺癌的演进，可以作为乳腺癌早期诊疗效果的关键预测分子。
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，而且是女性最常见癌症致死原因，大约有16%的女性因乳腺癌死亡[1]。近年来，尽管乳腺癌患者预后有所改善，但乳腺癌的治疗效果仍需发展，对于终末期远处转移患者犹为重要[1]。此外，药物耐药也给乳腺癌患者治疗带来极大威胁[2]，尤其是药物治疗过程中涉及基因再次突变、多条信号通路的变化，很大程度上限制了化疗药物治疗的有效性。因此，阐明乳腺癌发生、发展和演进的内在分子机制至关重要。
PTEN是位于10号染色体上磷酸酶和张力素同源物，是肿瘤演进中最常见的缺失或突变基因之一。PTEN能够将磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)催化为二磷酸盐产物(PIP2)，进而抑制PI3K通路活化，从而延缓肿瘤的恶性生物学行为[3,4]。PTEN以其抑癌作用而被广泛用于肿瘤研究中。其假基因PTENP1，包含一段与PTEN上游3’-UTR高度同源区域，能够调控PTEN表达，因此在肿瘤发生中表现出一定的调控作用[5]，且PTENP1亦能参与到抑制细胞增殖、促进细胞凋亡及抑制侵袭的过程中[6,7]。同时，PTENP1亦是一种长链非编码RNA(LncRNAs)。近来研究表明，lncRNA作为一种内源竞争性RNA，能够通过结合位点与miRNA相互作用，在调控miRNA功能中发挥重要作用[8]。相关研究显示高水平PTENP1能够靶向解除miR-19b对PTEN的抑制作用，促进PTEN的表达，进而抑制乳腺癌细胞增殖、转移及成瘤能力[6]。可见，miRNA能够直接与下游蛋白编码基因的3’-UTR结合，影响其在病理生理过程中的作用。miR-130a是一种致癌miRNA，能够靶向抑制PTEN，促进肿瘤细胞的增殖，导致肿瘤生长[9]。miR-20a也可作为PTEN的负性调控者，介导多发性骨髓瘤癌细胞的增殖、凋亡及侵袭能力[10]。在本研究中，我们发现PTENP1具有调控miR-20a介导其对乳腺癌演进的生物学作用。
PI3K/Akt信号通路是乳腺癌演进的重要通路之一，该通路激活于受体酪氨酸激酶活化之后，相关研究显示其已成为靶点，具有治疗潜能[11]。异常表达的PTENP1导致PTEN高表达同时抑制PI3K/Akt信号通路，进而阻滞前列腺癌及肾癌细胞的生长过程[12,13]。另一方面，miR-106b和miR-93能够通过抑制PTEN表达来调控乳腺癌细胞增殖、侵袭及转移过程，而这一过程又能通过上调PTEN表达而抑制[14]。这些研究提示PTENP1、miRNAs、PTEN可能与PI3K/Akt通路有关联。通过生物信息学预测分析，我们发现，PTENP1与miR-20a有相互结合序列，但关于miR-20a在PTENP1调控PTEN表达及三者介导乳腺癌演进的过程仍不清楚。
因此，本研究探讨PTENP1、miR-20a及PTEN在乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中的作用及其调控关系；通过上调和下调PTENP1及PTEN等探讨其在乳腺癌演进中的作用；通过进一步分析lncRNAPTENP1、miR-20a这两种非编码RNAs调控PTEN表达，探讨PTENP1/miR-20a/PTEN轴经由PI3K/Akt信号通路，介导乳腺癌生物学行为在演进中的作用机制；以期为临床靶向乳腺癌治疗提供新的潜在靶点。
方法
1、提取乳腺癌组织及细胞株中RNA，应用qRT-PCR方法检测PTENP1及PTEN表达水平。分析PTENP1及PTEN与乳腺癌预后关系。通过qRT-PCR方法检测转染PTENP1、siPTENP1后，乳腺癌细胞株中PTENP1的表达，明确转染效率。
2、特异性上调MDA-MB-231及MCF-7/ADR(阿霉素，adriamycin)细胞中PTENP1表达，检测转染后细胞的增殖、侵袭、药敏性及凋亡水平变化，并检测其对体内成瘤性的影响；特异性下调MCF-7及T47D细胞中PTENP1表达，检测转染后细胞的增殖、侵袭、药敏性及凋亡水平变化，并检测其对体内成瘤性的影响。
3、采用qRT-PCR方法检测乳腺癌组织及细胞株中miR-20a的表达水平；通过双荧光素酶报告实验检测PTENP1、PTEN与miR-20a之间的靶向调控关系；RIP实验验证PTENP1与miR-20a的结合关系；调控miR-20a的表达，采用qRT-PCR方法检测PTENP1与PTEN的表达水平改变。
4、采用qRT-PCR及westernblot方法，检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7/ADR共转染miR-NCmimic、miR-20amimic、Vector及PTENP1后，PTEN表达水平变化，并检测MCF-7、T47D细胞株共转染miR-NCinhibitor、miR-20ainhibitor、siSCR及siPTENP1后，PTEN表达水平改变；采用CCK8及平板克隆实验，检测共转染miR-20a及PTENP1后，乳腺癌细胞株的增殖性的变化；采用Transwell实验，检测共转染miR-20a及PTENP1后，乳腺癌细胞株的侵袭性的变化；采用CCK8实验、计算转染后细胞IC50值变化、通过ADR处理，检测处理后细胞克隆实验以及细胞凋亡实验，检测共转染后细胞药敏性及凋亡能力的变化。
5、将miR-NCmimic、miR-20amimic、vector及PTENP1共同转染至MDA-MB-231细胞中，通过westernblot方法检测PI3K/Akt信号通路活性变化；将miR-NCinhibitor、miR-20ainhibitor、siSCR及siPTENP1共同转染至MCF-7细胞中，通过westernblot方法检测PI3K/Akt信号通路活性变化；用DMSO、LY294002、controlsiRNA及siAkt处理MDA-MB-231细胞后，采用westernblot方法检测信号通路的变化；用DMSO、LY294002、controlsiRNA及siAkt处理MDA-MB-231细胞后，采用平板克隆及Transwell实验检测细胞增殖及侵袭能力的改变。
结果
第一部分PTENP1和PTEN在乳腺癌组织及细胞株中的表达
(1)在52对乳腺癌组织中，PTENP1及PTEN呈显著低表达水平；PTENP1及PTEN在乳腺正常细胞MCF-10A中表达水平最高，在MCF-7及T47D中水平显著降低，而在乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231、耐药株MCF-7/ADR及T47D/ADR细胞株中，表达更低；
(2)PTENP1及PTEN在Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌组织中表达显著高于Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌中表达；
(3)生存分析结果表明，高水平PTENP1及PTEN与患者高生存预后相关，而低水平PTENP1及PTEN通常预示乳腺癌患者的不良预后；
(4)将PTENP1及vector转染至MDA-MB-231、MCF-7/ADR及T47D/ADR细胞中，结果表明PTENP1的水平显著增高；将siPTENP1及siSCR转染至MCF-7及T47D细胞中，结果表明PTENP1的水平显著降低。
第二部分调控PTENP1表达对乳腺癌演进的影响
(1)在MDA-MB-231及MCF-7/ADR细胞中，上调PTENP1后，CCK8实验表明其增殖能力显著降低；平板克隆实验表明，上调PTENP1后，细胞形成克隆能力显著降低；Edu染色及Ki67染色结果均表明转染后的细胞增殖能力显著降低；
(2)转染PTENP1后，MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭能力显著下降；
(3)上调PTENP1表达后，MCF-7/ADR细胞对ADR的耐药性显著降低，对ADR更加敏感；通过计算IC50值，转染后的MCF-7/ADR细胞对ADR的耐受性显著降低；将转染后的MCF-7/ADR细胞，用ADR处理，其细胞克隆能力更为下降；流式细胞仪结果表明，上调PTEP1后，细胞经ADR处理后，凋亡率显著增多；JC-1染色证实线粒体膜电位发生改变；TUNEL实验证实ADR处理后，细胞凋亡的发生；凋亡相关分子水平的改变也证实在上调PTENP1水平后，细胞对药物更为敏感，凋亡水平增强；
(4)上调PTENP1后，转染后细胞的体内成瘤能力减弱，而同时以ADR处理后，瘤体积更小；对上述瘤组织进行石蜡切片染色，免疫组化染色结果表明，PTEN水平显著增强，而Ki67水平显著下降；
(5)下调MCF-7及T47D细胞中PTENP1水平后，CCK8实验表明其增殖能力显著增强；平板克隆实验表明，敲低PTENP1后，细胞形成克隆能力显著增强；Edu染色及Ki67染色结果均表明转染后的细胞增殖能力显著升高；
(6)转染siPTENP1后，与对照组相比，MCF-7细胞的迁移、侵袭能力显著增强；
(7)下调PTENP1表达后，MCF-7细胞对ADR的抵抗性显著增强；通过计算IC50值，转染后的MCF-7细胞对ADR的耐药性增强；以ADR处理转染后的MCF-7细胞，其克隆形成能力显著升高；流式细胞仪结果表明，下调PTEP1后，MCF-7细胞凋亡率显著降低；JC-1染色证实转染后的细胞线粒体膜电位发生改变；TUNEL实验同样证实凋亡的发生；下调PTENP1水平后，凋亡相关分子水平的改变也证实凋亡水平减弱；
(8)敲低PTENP1水平，MCF-7细胞的体内成瘤能力显著增强，而同时以ADR处理后，瘤体积仍增大；对上述瘤组织进行石蜡切片染色，免疫组化染色结果表明，PTEN水平显著降低，而Ki67水平显著增强。
第三部分PTENP1是miR-20a的直接靶点并正向调控PTEN
(1)miR-20a在乳腺癌中的表达显著高于相应癌旁组织中表达；miR-20a在乳腺癌细胞株中表达显著高于正常乳腺细胞株MCF-10A中表达，而且在乳腺癌高转移性细胞株MDA-MB-231中表达高于低转移性细胞株MCF-7、T47D中表达；在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR、T47D/ADR中表达高于非耐药细胞株MCF-7、T47D中表达；
(2)通过统计学相关性分析证实，PTENP1与miR-20a之间存在负性相关关系，Spearman系数为-0.7223；双荧光素酶报告实验结果表明，PTENP1与miR-20a结果存在靶向调控关系；
(3)特异性上调MCF-7及T47D细胞中miR-20a水平后，PTENP1表达显著降低；特异性下调MDA-MB-231、MCF-7/ADR及T47D/ADR细胞中miR-20a水平后，PTENP1表达显著升高；
(4)RIP实验结果表明，在乳腺癌细胞株中，PTENP1和miR-20a存在表达水平富集，说明二者可能存在之间作用关系；
(5)通过统计学相关性分析证实，PTEN与miR-20a之间存在负性相关关系，Spearman系数为-0.7929；双荧光素酶报告实验结果表明，PTEN与miR-20a结果存在靶向调控关系；
(6)特异性上调MCF-7及T47D细胞中miR-20a水平后，PTEN表达显著降低；特异性下调MDA-MB-231、MCF-7/ADR及T47D/ADR细胞中miR-20a水平后，PTEN表达显著升高。
第四部分miR-20a与PTENP1通过调控PTEN表达逆转乳腺癌演进
(1)在MDA-MB-231细胞及MCF-7/ADR细胞中，转染miR-20amimic后，PTEN水平显著降低，转染PTENP1后，PTEN水平显著升高，而当共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对PTEN的促进作用；
(2)CCK8结果表明，在MDA-MB-231细胞及MCF-7/ADR细胞中，转染miR-20amimic后，乳腺癌细胞的增殖性增高，转染PTENP1后，转染后细胞增殖能力降低，共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对转染细胞增殖能力的抑制作用；平板克隆实验也显示了相同趋势；
(3)Transwell结果表明，在MDA-MB-231细胞中，转染miR-20amimic后，乳腺癌细胞的侵袭性增强，转染PTENP1后，细胞的侵袭能力显著降低，共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对细胞侵袭能力的抑制作用；
(4)CCK8结果表明，在MCF-7/ADR细胞中，转染miR-20amimic后，乳腺癌细胞对ADR的抵抗性增强且IC50值增高，转染PTENP1后，细胞的耐药性降低且IC50值减小，共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对细胞耐药性的敏感作用；ADR处理后，MCF-7/ADR细胞的平板克隆能力减小，但转染miR-20amimic组，细胞增殖能力仍最高，而转染PTENP1后，细胞增殖能力降低，共转染后，平板克隆能力有所恢复；在MCF-7/ADR细胞中，转染miR-20amimic后，ADR诱导的细胞凋亡率减少，而转染PTENP1后，ADR诱导的细胞凋亡率增高，共转染miR-20amimic和PTENP1后，miR-20amimic逆转了PTENP1对细胞细胞凋亡的抑制作用；
(5)在MCF-7细胞及T47D细胞中，转染miR-20ainhibitor后，PTEN水平显著升高，转染siPTENP1后，PTEN水平显著降低，而当共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对PTEN的抑制作用；
(6)CCK8结果表明，在MCF-7细胞及T47D细胞中，转染miR-20ainhibitor后，细胞的增殖性降低，转染siPTENP1后，细胞增殖能力增强，共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对转染细胞增殖能力的促进作用；平板克隆实验也显示了相同趋势；
(7)Transwell结果表明，在MCF-7细胞中，转染miR-20ainhibitor后，乳腺癌细胞的侵袭性减弱，转染siPTENP1后，细胞的侵袭能力显著升高，共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对细胞侵袭能力的促进作用；
(8)CCK8结果表明，在MCF-7细胞中，转染miR-20ainhibitor后，乳腺癌细胞对ADR的抵抗性降低且IC50值减小，转染siPTENP1后，细胞的耐药性增强且IC50值升高，共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对细胞的耐药性；ADR处理后，MCF-7细胞的平板克隆能力减小，但miR-20ainhibitor后，细胞增殖能力降低，转染siPTENP1组，细胞增殖能力最高，共转染后，平板克隆能力有所恢复；在MCF-7细胞中，转染miR-20ainhibitor后，ADR诱导的细胞凋亡率升高，而转染siPTENP1后，ADR诱导的细胞凋亡率减少，共转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，miR-20ainhibitor逆转了siPTENP1对细胞细胞凋亡的促进作用。
第五部分PTENP1/miR-20a/PTEN轴通过激活PI3K/Akt通路介导乳腺癌演进
(1)在MDA-MB-231细胞中，转染miR-20amimic后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平显著升高，PTEN水平显著下降，而Akt水平没有发生改变；转染PTENP1后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平显著下降，PTEN水平显著升高，而Akt水平没有发生改变；共同转染miR-20amimic和PTENP1后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平恢复如对照组；在MCF-7细胞中，转染miR-20ainhibitor后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平显著降低，PTEN水平显著升高，而Akt水平没有发生改变；转染siPTENP1后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平显著增强，PTEN水平显著降低，而Akt水平没有发生改变；共同转染miR-20ainhibitor和siPTENP1后，p-110α、p-Akt308、p-Akt473及NF-κB水平恢复；
(2)通过LY294002处理MDA-MB-231细胞后，与DMSO组相比，PI3K/Akt信号通路活性降低；通过siAkt处理MDA-MB-231细胞后，与controlsiRNA组相比，PI3K/Akt信号通路活性显著降低；
(3)通过LY294002处理MDA-MB-231细胞后，与DMSO组相比，MDA-MB-231细胞的增殖能力显著下降；通过siAkt处理MDA-MB-231细胞后，与controlsiRNA组相比，MDA-MB-231细胞的侵袭能力显著下降；
结论
1.PTENP1和PTEN在乳腺癌组织及细胞株中持续低表达，并且与乳腺癌的临床分期及预后密切相关，在ER阴性的乳腺癌细胞中，PTENP1表达更低；
2.上调乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-7/ADR)中PTENP1的表达，能抑制癌细胞增殖、侵袭，诱导细胞凋亡，增强对阿霉素的敏感性以及减弱体内成瘤能力；下调(MCF-7和T47D)乳腺癌细胞株中PTENP1的表达，则产生相反作用；PTENP1能够介导乳腺癌的演进，发挥抑癌作用；
3.miR-20a在乳腺癌组织及高转移细胞株、阿霉素耐药细胞株持续高表达，提示预后不良。miR-20a与PTENP1和PTEN存在负性靶向调控关系，PTENP1通过吸附miR-20a，解除miR-20a对PTEN的靶向抑制作用；
4.共同调控乳腺癌细胞株中miR-20a和PTENP1的表达，通过改变PTEN水平，介导乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力及对阿霉素药物敏感性发生改变，显著影响乳腺癌演进，而miR-20a能够显著逆转PTENP1对乳腺癌的负调控作用；
5.miR-20a能负靶向调控PTEN的表达水平，增强PI3K/Akt信号通路的活性，从而促进乳腺癌细胞增殖和侵袭；而PTENP1则正靶向调控PTEN的表达水平，降低PI3K/Akt信号通路的活性，降低活性的PI3K/Akt信号通路能够延缓乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。
6.PTENP1/miR-20a/PTEN轴由经PI3K/Akt通路介导乳腺癌的演进，可以作为乳腺癌早期诊疗效果的关键预测分子。