木质纤维素材料是地球上最丰富的可再生资源。随着石油、煤炭、天然气等不可再生的化石能源面临着枯竭的危险,寻找替代它们的可再生能源成为了当务之急。伴随着木质纤维素材料生产燃料乙醇技术的发展,纤维素酶受到人们越来越多的关注,成为了很多学者研究的重点。纤维素酶在木质纤维素材料生物转化生成燃料乙醇或者其他高附加值的产物的过程中发挥了关键作用。特别是纤维二糖水解酶家族(CBHs)是纤维素酶系中的关键酶,一般能够占到胞外分泌蛋白含量的60%。它可以破坏纤维素的结晶区,在提高纤维素转化率方面发挥了重要作用。纤维素酶作用于天然的木质纤维素材料时,存在酶解效率低,酶制剂生产成本高的问题,难以满足工业化生物质转化的需求。如何能够改造纤维素酶,提高纤维素酶的酶活力和稳定性,就成为相关研究的热点。我们选择纤维素酶系中的关键酶——纤维二糖水解酶作为研究对象,系统地研究了影响CBH比酶活力和稳定性的各种因素,为CBH蛋白质改造提供了良好的理论基础。为了深入研究纤维二糖水解酶酶活力的影响因素和催化机制,本文系统地研究了纤维二糖水解酶的多样性。将分五章分别侧重纤维二糖水解酶的功能、性质、催化现象、种类及结构域功能等多样性进行介绍。主要研究内容及结果如下：1.从斜卧青霉(Pencillium decumbens)胞外粗酶液中分离纯化了无酶活力的纤维素降解协同作用蛋白CBHI-A,首次发现了CBHI的功能多样性从斜卧青霉胞外蛋白中分离纯化了一种没有酶活力的纤维素降解协同作用蛋白。该蛋白通过二级质谱鉴定为CBHI,命名为CBHI-A.研究表明,以pNPC、CMC、水杨苷为底物时,CBHI-A没有检测到任何酶活力。当CBHI-A单独作用于滤纸等木质纤维素材料时,没有发现水解活性,没有任何还原糖生成。但是和商业纤维素酶共同作用时,表现出强烈的降解木质纤维素的协同作用。向JAN-A、JU-A10、NS-50013、NS-50012,GEN中添加少量该蛋白,来水解玉米芯粉时,葡萄糖得率分别提高了10%到60%。仅仅通过一种蛋白就能够使纤维素酶的水解效率大幅提高,尚不多见。为了分析CBHI-A协同作用的机理,用CBHI-A单独处理棉纤维,通过FTIR、XRD、SEM等方法分析了棉纤维处理前后结构上的差异。研究结果显示,CBHI-A单独处理后的棉纤维,纤维素的结晶度降低了34%,氢键强度降低了17%,棉纤维的直径变粗了9%。这说明CBHI-A能够发挥协同作用的原因为：CBHI-A可以破坏纤维素的氢键,降低纤维素的结晶度,使纤维素微纤维变的更加疏松,膨胀,有利于其它纤维素酶组分对底物的降解。2.系统地分析了N-糖基化多样性对CBHI性质的影响在斜卧青霉的胞外粗酶液中,分离纯化了四种不同形式的CBHI。通过串联质谱鉴定发现,这四种蛋白是由同一个基因表达出的。它们的氨基酸序列和基因序列完全相同,但是分子量、比酶活力、酶学性质差异很大。为了深入研究CBHI性质多样性的原因,我们分别从蛋白水平和基因水平两个层面对CBHI的N-糖基化进行了研究。首先,我们建立了用蛋白质肽指纹图谱(PMF)分析蛋白质N-糖链结构的方法。比较四种CBHI的肽指纹图谱发现,CBHI的N-糖基化位点Asn-137修饰的N-糖链越长,CBHI的比酶活力越高,说明Asn-137糖基化起到了促进CBHI比酶活力的作用。其次,我们在基因水平上,将cbhl基因的两个糖基化位点Asn-137、Asn-470分别进行了定点突变,并在斜卧青霉中进行了同源表达。研究表明,不同糖基化位点对CBHI比酶活力的影响是不同的。在Asn-137位发生N-糖基化,可起到促进外切酶酶活力的作用。而在Asn-470位发生N-糖基化,却可抑制外切酶的酶活力。第三,研究表明,N-糖基化对CBHI的稳定性起到了重要作用。去糖基化的CBHI比酶活力很高,但是稳定性极差。在50℃时半衰期降低到40min。针对是否发生N-糖基化、糖基化的位点、N-糖链结构可能对CBHI多样性造成的影响,本文系统地进行了研究。3.分别以结晶纤维素、无定形纤维素及纤维素类似物为底物,研究了CBHI催化现象的多样性,探索了CBHI催化作用的机理为了研究CBHI的催化机理,在基因水平上分别对CBHI活性孔道中的四个糖基结合位点实行定点突变,比较不同CBHI的突变体(CBHI-W63A、 CBHI-W65A、CBHI-W398A、CBHI-W407A)分别水解结晶纤维素、无定形纤维素、纤维素类似物不同底物时的催化现象。实验结果显示无论哪一个糖基结合位点发生突变,CBHI水解微晶纤维素,磷酸膨胀纤维素的能力均大幅降低,说明了这四个糖基结合位点对于糖链在酶蛋白催化孔道中正确定位,正确水解发生重要作用。当CBHI在W398位发生突变后,由于底物无法在催化过程中扭转到底物结合位点+1位,无法完成催化过程,所以CBHI-W398A无法水解结晶纤维素和无定形纤维素。当底物为纤维素的类似物对硝基苯纤维二糖苷(pNPC)时,CBHI的突变体水解pNPC的结果和水解天然纤维素的结果恰恰相反：CBHI-W398A水解pNPC的效率很高,而CBHI-W65A则不能水解pNPC。荧光光谱分析表明,pNPC结构中的pNP与色氨酸W之间的吸引力很强,强烈吸引pNP进入CBHI的催化孔道,并且越靠近孔道出口端,牵引力越大。所以,即使CBHI在398位发生突变,pNPC无法借助398位色氨酸的作用实现底物的翻转,但是凭借pNP和色氨酸之间强大吸引力的作用,pNPC依然可以到达W407位,完成催化过程。上述实验给予我们提示,CBHI的突变体检测到的pNPC酶活力与其水解纤维素材料的结果是不吻合的,说明了不能简单地将pNPC酶活力作为水解天然纤维素材料的指标。我们平时检测纤维素酶活性往往是以纤维素的类似物或衍生物为底物进行的,而非使用异质性的天然纤维素底物。严格说,底物类似物只能用于区分酶蛋白的分类,不能反映酶蛋白水解天然纤维素的真实活性。这也可以用于解释为什么之前报道的CBHI具有高pNPCase酶活力,却在水解天然底物时转化能力很低的原因。本实验结果也证明了酶蛋白水解可溶性或不溶性底物的活力是没有直接相关性的。4.从斜卧青霉胞外粗酶液中分离到一种新型纤维二糖水解酶Ⅱ(PdCel6A),其性质测定及应用展现了CBH种类的多样性从斜卧青霉的胞外粗酶液中分离纯化了一种新型的纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHII)。其氨基酸序列与烟曲霉(A spergillus fumigatus) CBHII(又称Ce16A)的氨基酸序列相似度很高,从而命名其为PdCel6A。该蛋白的性质十分新颖,酶学性质介于CBHI和CBHII之间。类似于CBHI的性质是,以pNPC为底物时,PdCel6A的比酶活力可以达到1.9IU/mg。这是首次发现CBHII可以水解pNPC,为Ce16A的催化方式类似于内切酶的猜测提供了有力的证据。PdCel6A具有极强的耐酸性,在pH2条件下保存6个小时,仍然能够保持最大酶活力的80%。在同步糖化发酵过程中,添加少量PdCel6A后,乙醇、L-乳酸的产量分别提高了20%和10%。5.通过分析连接区的长度和柔性对催化活性产生的影响,研究了PdCel6A连接区潜在的生物学功能,展现了结构域功能的多样性。将PdCel6A和糖苷水解酶第六家族的蛋白质进行了氨基酸序列比对,发现PdCel6A的吸附结构域和催化结构域与其他第六家族蛋白的氨基酸序列相似度很高。但是其连接区的氨基酸序列特别长,大约长出了11个氨基酸左右。为了研究连接区的潜在功能,我们分别研究了连接区的长度和柔性对PdCel6A酶学性质的影响。首先,在基因水平上将PdCel6A的连接区缩短了11个氨基酸序列。研究表明,随着连接区氨基酸序列的缩短,其能够水解pNPC的性质随之消失,但水解结晶纤维素的能力显著增强。其次,在基因水平上将PdCel6A的连接区中六个氨基酸定点突变为六个脯氨酸,彻底破坏了PdCel6A连接区的柔性。研究发现,PdCel6A连接区的柔性消失,影响了其CBM区和CD区之间协作关系,其水解微晶纤维素和pNPC的能力也随之消失。这证明了连接区的柔性是酶催化过程的必需条件。上述实验显示,纤维素酶的连接区除了起到连接吸附结构域和催化结构域的作用以外,还具有其它潜在功能。随着连接区的长度及柔性的增加,可能会使纤维素酶展现出新的酶活性。