目的马兜铃酸肾病（AAN）是一种快速进展的肾小管间质疾病,对其发病机制的认识尚未完全达成共识。近年来有关马兜铃酸（AA）致肾小管周毛细血管网丢失造成小管间质缺血缺氧、小管萎缩,间质纤维化的研究有增加趋势。内皮细胞裱褙血管内壁,是血管损伤的关键靶组织,直接接受血液中有害物质毒害,承受各种应激,内皮细胞具有多种细胞因子分泌功能,信息传递、抗凝等复杂的舒缩调节功能,直接参与血管的形成和重塑。所以AA对血管内皮细胞（VEC）的损伤及拮抗途径的研究,将为慢性马兜铃酸肾病（CAAN）的治疗,寻找一条新的途径。本实验通过体外培养人脐静脉内皮细胞系（HUVEC）,FLuo-3钙离子探针检测HUVEC胞内钙离子浓度([Ca²⁺]i)变化,ELISA法测定细胞培养上清液中血栓调节蛋白（TM）,倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态及超微结构改变。探讨AA对VEC([Ca²⁺]i)的影响,并观察不同浓度的羟苯磺酸钙在不同培养时间点对VEC钙离子稳态的影响,对VEC的保护作用。材料与方法一、实验材料主要试剂:人脐静脉内皮细胞系（HUVEC）、DMEM低糖培养基、优等胎牛血清、胰蛋白酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、二甲基亚砜（DMSO）、马兜铃酸钠盐（工作浓度10mg/l）、羟苯磺酸钙原粉、FLuo-3,AM 5μM、血栓调节蛋白（TM）ELISA预包被试剂盒。主要仪器:温浴箱、Olympus光学显微镜、高压锅、冰箱、显微镜带自动显微照相装置、细胞内钙离子荧光成像测定系统。二、实验方法1、细胞培养HUVEC用含10%胎牛血清,10μg/ml的链霉素,10U/ml的青霉素的低糖DMEM培养基中培养,37℃,5%CO₂恒温培养箱孵育。2、实验分组及处理培养HUVEC随机分为三组:①正常对照组（对照组）;②AA-Na组（AA组）;③羟苯磺酸钙组（干预组）。将AA-Na粉加入DMEM培养基中,配置成10mg/l的溶液。将羟苯磺酸钙原粉加入DMEM培养基中,配置成浓度为10μM、25μM、50μM的溶液。对照组用完全DMEM培养基培养,AA组和干预组均用含AA-Na的DMEM培养基培养24h后,干预组再随机分三组,分别加入含上述浓度羟苯磺酸钙的DMEM培养基中再培养24h、48h。3、各组细胞([Ca²⁺]i)测定将各组细胞分别接种于塑料培养皿中。按上述处理后,弃原培养液,每皿用无钙磷酸盐缓冲液（PBS液）（pH7.2）洗2次,定容至1ml,加入已配制好的FLuo-3,AM工作液（5μM）50μl,37℃,5%CO₂孵箱中孵育40min,无钙PBS液洗2次后按组进行试验。将负载FLuo-3,AM的各组细胞置于细胞内钙离子荧光成像测定系统操作台上,37℃测定单个细胞钙荧光强度。4、各组细胞培养上清液中TM含量测定收集各组细胞培养上清液各100μl,按照TM检测试剂盒所示ELISA方法及程序检测,每组重复6次,检测各组TM含量。5、各组细胞形态观察各组细胞置倒置显微镜及投射电镜下,观察总体形态、单层细胞变化及细胞超微结构变化情况。三、统计学处理所有计量资料以（（?）±S）表示,采用SPSS16.0统计软件进行分析,多组间样本均数比较用方差分析。P＜0.05为有统计学意义。结果一、各组细胞([Ca²⁺]i)变化应用AA-Na后,HUVEC([Ca²⁺]i)迅速升高,5分钟内达高峰,70分钟后降至平稳水平。AA组平均([Ca²⁺]i)明显高于对照组,P＜0.05。干预组平均([Ca²⁺]i)与AA组相比,均有一定程度的下降。羟苯磺酸钙对([Ca²⁺]i)的作用,其下降趋势呈浓度依赖性,培养48h后,与培养24h的值相比,虽略有下降,但两者比较无显著性差异。二、各组细胞培养上清液TM检测结果应用AA-Na后,TM明显增多,与对照组相比,P＜0.05。而应用了不同浓度的羟苯磺酸钙钙处理后,各组的TM含量均有一定的下降,羟苯磺酸钙浓度为25μM、50μM时,细胞培养24h或48h,与对照组相比,p＞0.05,与AA组相比,P＜0.05。三、各组细胞形态观察结果（一）倒置相差显微镜观察结果对照组:细胞贴壁单层生长,呈铺路石样排列,细胞轮廓清晰,胞核为圆形或椭圆形,细胞生长旺盛,几乎无脱落;AA组:细胞贴壁能力减弱,部分在培养液中悬浮,贴壁细胞体积缩小、变圆;不同浓度羟苯磺酸钙下细胞贴壁生长良好,少有脱落。（二）透射电镜细胞超微结构观察结果1、电镜下各组细胞核变化情况对照组正常细胞形态,核完整;AA组细胞核形不规则、凹陷;干预组:细胞的核形均比较规则。2、各组细胞胞质中内质网线粒体改变情况对照组内质网、线粒体正常;AA组粗面内质网扩张呈池状,线粒体少数有嵴缺损,空泡变性;干预组线粒体出现嵴缺损变少,粗面内质网比较完整。结论AA能使VEC钙超载,致内皮破坏,TM增加,内质网和线粒体破坏;羟苯磺酸钙可以通过保护线粒体、内质网,减少VEC钙超载,保护VEC。