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背景：在我国,胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤。由于目前早期诊断率不高,因而许多患者就诊时多已处于中晚期而失去了手术机会。化学治疗(简称化疗)成为中晚期胃癌的主要治疗方法,其对胃癌病人生存期虽有改善但效果仍不能令人满意。胃癌细胞化疗耐药性的产生是导致化疗失败的重要原因。胃癌细胞化疗耐药性的产生涉及一系列的复杂机制。细胞内负责生长和凋亡的信息传导通路的激活(失活)是肿瘤细胞获得化疗耐药性的一个重要方面。这些信号通路可以通过转录后的调控机制广泛参与细胞的生命活动,其中涉及到肿瘤细胞的耐药。于红刚教授前期研究表明,PI3K/AKT通路在胃癌细胞化疗耐药性中发挥着关键性作用,PTEN基因可以减弱胃癌细胞的耐药行为,但其中的具体机制仍有待进一步研究。胃癌是一种对化疗相对敏感的恶性肿瘤,逆转其对化疗药物的耐药具有重要的意义。由此可见,深入研究细胞内信号通路的作用及调控机制,对明确胃癌耐药发生的深层分子机制具有十分重要的意义,也为寻找胃癌治疗的新方法提供理论基础。第一部分AKT1基因在胃癌细胞对阿霉素耐药中的作用及与Notch-1和PTEN的关系研究目的：研究在胃癌细胞中阿霉素对AKT1、Notch-1和PTEN基因的表达水平的影响及可能的调控机制,探索AKT1在胃癌细胞对阿霉素耐药中的具体作用。方法：1.在培养的MKN28、MKN45、BGC823、SGC7901和AGS人胃癌细胞株上,用阿霉素(3μM)孵育不同时间,免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应技术(Real-time PCR)检测细胞中AKT1、Notch-1和PTEN表达的改变。2.构建AKT1-shRNA慢病毒载体和AKT质粒载体转染胃癌细胞MKN28,并使用阿霉素(3μM)处理,比较转染前后AKT1、p-AKT(S473)、Notch-1和PTEN蛋白表达的变化及对阿霉素诱导凋亡的影响。3.电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)检测通用型NFκB的DNA结合活性和CBF-1的DNA结合活性。结果：1.阿霉素呈时间梯度诱导胃癌细胞内AKT1、Notch-1和PTEN基因RNA水平及蛋白水平表达量增加。2.采用RNAi干扰技术,即AKT1shRNA (pGCSIL-GFP-AKT1),敲低AKT1表达量,可以降低胃癌细胞的化疗耐药性,增强阿霉素诱导的细胞凋亡(P<0.01)。同时p-AKT(S473)、Notch-1和PTEN表达下降。而过表达AKT1活性质粒诱导Notch-1和PTEN基因蛋白水平表达量增加,PDTC (pyrrolidine dithiocarbam-ate, NFκB活性特异性抑制剂,10μM)能够抑制这种增加。3.AKT1shRNA能够抑制由阿霉素诱导的NFκB的DNA结合活性增强。同样的结果见于检测CBF-1活性。结论：1.阿霉素诱导胃癌细胞内AKT1、Notch-1和PTEN基因表达水平平行性增加,三者之间存在某种关联。2.敲低AKT1基因可以使Notch-1和PTEN表达下降,胃癌细胞化疗耐药性下降。3.AKT1可能是调控Notch-1和PTEN基因表达的上游,KT1影响Notch-1和PTEN基因表达可能是通过NFKB通路。第二部分AKT1调控阿霉素诱导的Notch-1基因转录的机制研究目的：研究在胃癌细胞中阿霉素诱导的Notch-1基因表达增加的具体机制。方法：1.构建不同长度的Notch-1荧光素酶报告基因载体,用脂质体转染法将不同长度的报告基因载体分别转染至胃癌MKN28细胞株；采用双荧光素酶报告基因系统评估不同处理因素下Notch-1启动子活性。2EMSA技术检测胃癌细胞MKN28内特异性NFκB(包含结合位点序列)及突变型NFκB探针活性。3.进步应用染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)方法研究NFκB(p65)蛋白与Notch-1启动子序列间结合的情况。结果：1.AKT1shRNA和PDTC (10μM)均能抑制阿霉素诱导的Notch-1荧光素酶报告基因活性增强。2.在胃癌细胞MKN28内,Notch-1启动子区域存在2个阳性的NFκB结合位点。3. NFκB亚基p65可能是影响Notch-1转录的一个转录因子。结论：阿霉素诱导AKT1和Notch-1表达增加,Notch-1是AKT1的下游靶分子,AKT1通过转录因子NFκB (p65)调控Notch-1的转录。第三部分Notch-1和PTEN在胃癌对阿霉素耐药中的作用及机制研究目的：研究Notch-1和PTEN在胃癌组织及细胞中的表达,并且研究影响PTEN表达水平的可能调控机制,探究它们在胃癌对阿霉素耐药中的具体作用方法：1.收集临床胃癌组织标本,免疫印迹法(Western blot)和免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测Notch-1和PTEN表达水平,分析两者表达水平之间的关系。2.构建PTEN荧光素酶报告基因,检测不同条件下其活性水平的变化。3.转染Notch-1siRNA敲低Notch-1的表达,EMSA检测转录因子CBF-1的活性,免疫印迹法检测PTEN的水平；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒测定Notch-1siRNA和阿霉素作用下胃癌细胞MKN28的凋亡率。4.向MKN28细胞转染PTEN质粒载体和PTEN siRNA载体,联合阿霉素,观察转染前后AKT1, p-AKT(S473)表达的变化,以及细胞的凋亡水平。结果：1.与癌旁组织相比,胃癌组织中Notch-1和PTEN均弱表达(或缺失),两者之间存在比较强的正相关。(r=0.866)2. PTEN报告基因载体内含CBF-1结合位点序列,AKT1shRNA、PDTC、Notch-1siRNA均能导致PTEN报告基因活性降低(P<0.05)。3. Notch-1siRNA能使CBF-1的活性下降；敲低Notch-1表达会抑制PTEN的表达,降低阿霉素诱导的细胞凋亡率(P<0.05)4.过表达PTEN是可以使AKT磷酸化水平明显下降,提高阿霉素诱导的细胞凋亡水平(P<0.05)。敲低PTEN的表达作用则正好相反。但两者均对AKT1基因表达无明显影响。结论：1. Notch-1和PTEN在胃癌组织中表达明显下降。2.Notch-1基因在胃癌细胞对阿霉素耐药中发挥着重要作用,其机制可能与调控抑癌基因PTEN的表达有关。